| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-25页 |
| 1.1 几丁质 | 第12-14页 |
| 1.1.1 几丁质的结构 | 第12-13页 |
| 1.1.2 几丁质在昆虫体内的分布 | 第13页 |
| 1.1.3 几丁质在昆虫体内的代谢过程 | 第13-14页 |
| 1.2 昆虫几丁质酶 | 第14-21页 |
| 1.2.1 18家族几丁质酶 | 第14页 |
| 1.2.2 18家族几丁质酶的序列保守性 | 第14-15页 |
| 1.2.3 昆虫几丁质酶的分类及结构组成 | 第15-19页 |
| 1.2.4 昆虫几丁质酶的生理功能 | 第19-21页 |
| 1.2.5 昆虫几丁质酶的酶学性质 | 第21页 |
| 1.3 洲玉米螟几丁质酶 | 第21-24页 |
| 1.3.1 亚洲玉米螟 | 第21-22页 |
| 1.3.2 洲玉米螟Ⅰ家族几丁质酶 | 第22页 |
| 1.3.3 洲玉米螟Ⅳ家族几丁质酶 | 第22-23页 |
| 1.3.4 洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶 | 第23-24页 |
| 1.4 本论文的选题依据和研究内容 | 第24-25页 |
| 1.4.1 选题依据 | 第24页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第24-25页 |
| 2 亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶基因OfCHTⅢ的克隆及其序列分析 | 第25-35页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第25-29页 |
| 2.2.1 总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2 反转录 | 第26页 |
| 2.2.3 同源序列获取 | 第26页 |
| 2.2.4 3’RACE获得3’端序列 | 第26-28页 |
| 2.2.5 5’RACE获得5’端序列 | 第28页 |
| 2.2.6 序列分析 | 第28-29页 |
| 2.3 实验结果 | 第29-34页 |
| 2.3.1 亚洲玉米螟Ⅲ家族几丁质酶基因OfCHTⅢ | 第29页 |
| 2.3.2 序列比对验证亚洲玉米螟来源的OfCHTⅢ基因 | 第29页 |
| 2.3.3 OfCHTⅢ编码的蛋白质性质预测 | 第29-30页 |
| 2.3.4 已知的双催化域几丁质酶序列保守性分析 | 第30-32页 |
| 2.3.5 OfCHTⅢ的进化分析 | 第32-34页 |
| 2.4 小结 | 第34-35页 |
| 3 亚洲玉米螟OfChtⅢ的重组表达、分离纯化及性质表征 | 第35-55页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第35-41页 |
| 3.2.1 pPIC9-OfChtⅢ及pPIC9-OfChtⅢ-Δ2表达载体构建 | 第35-36页 |
| 3.2.2 pPIC9-OfChtⅢ及pPIC9-OfChtⅢ-Δ2表达载体转化毕赤酵母GS115 | 第36-37页 |
| 3.2.3 重组OfChtⅢ及OfChtⅢ-Δ2的诱导表达 | 第37页 |
| 3.2.4 重组OfChtⅢ及OfChtⅢ-Δ2的分离纯化 | 第37-38页 |
| 3.2.5 OfChtⅢ断裂位点分析 | 第38页 |
| 3.2.6 OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-2的N-糖基化测定 | 第38页 |
| 3.2.7 重组OfChtⅢ-1、OfChtⅢ-2及OfChtⅢ-Δ2的酶活测定 | 第38-39页 |
| 3.2.8 重组OfChtⅢ-1、OfChtⅢ-2及OfChtⅢ-Δ2的最适pH | 第39页 |
| 3.2.9 两个催化域OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-Δ2的催化动力学 | 第39-40页 |
| 3.2.10 两个催化域OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-Δ2对寡聚底物的选择性及水解模式 | 第40页 |
| 3.2.11 OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-Δ2对高聚几丁质的水解选择性及协同作用 | 第40-41页 |
| 3.3 实验结果 | 第41-51页 |
| 3.3.1 pPIC9-OfChtⅢ及pPIC9-OfChtⅢ-Δ2载体构建及酵母转化 | 第41-42页 |
| 3.3.2 重组OfChtⅢ-1、OfChtⅢ-2及OfChtⅢ-Δ2的分离纯化 | 第42-43页 |
| 3.3.3 OfChtⅢ的断裂位点分析 | 第43页 |
| 3.3.4 OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-2的N-糖基化分析 | 第43-46页 |
| 3.3.5 OfChtⅢ-1、OfChtⅢ-2及OfChtⅢ-Δ2的催化最适pH | 第46-47页 |
| 3.3.6 两个催化域OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-Δ2的催化动力学 | 第47页 |
| 3.3.7 两个催化域OfChtⅢ-1及OfChtⅢ-Δ2对寡聚底物的选择性及水解模式 | 第47-49页 |
| 3.3.8 OfChtⅢ-1与OfChtⅢ-Δ2对高聚几丁质的水解选择性及协同作用 | 第49-51页 |
| 3.4 分析讨论 | 第51-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-55页 |
| 4 OfChtⅢ的全长表达 | 第55-65页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第55-58页 |
| 4.2.1 OfChtⅢ的断裂时期验证 | 第55页 |
| 4.2.2 通过改造培养基获取全长蛋白 | 第55-56页 |
| 4.2.3 利用蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168进行重组表达 | 第56页 |
| 4.2.4 构建pPIC9-OfChtⅢ-linker突变体 | 第56页 |
| 4.2.5 OfChtⅢ-M的转化、诱导表达及分离纯化 | 第56-57页 |
| 4.2.6 胞内表达载体pPIC3.5k-OfChtⅢ的构建 | 第57页 |
| 4.2.7 OfChtⅢ-DGY的转化、诱导表达、分离纯化及活力测定 | 第57页 |
| 4.2.8 凝胶筛分、Western blot、Native PAGE及底物胶验证全长蛋白 | 第57-58页 |
| 4.3 实验结果 | 第58-64页 |
| 4.3.1 OfChtⅢ的断裂时期验证 | 第58页 |
| 4.3.2 通过改造培养基获取全长蛋白 | 第58-60页 |
| 4.3.3 利用蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168进行重组表达 | 第60-61页 |
| 4.3.4 OfChtⅢ-M的构建、转化、诱导表达及分离纯化 | 第61页 |
| 4.3.5 OfChtⅢ-DGY的构建、转化、诱导表达、分离纯化及活力测定 | 第61-62页 |
| 4.3.6 凝胶筛分、Western blot、Native PAGE及底物胶验证全长蛋白 | 第62-64页 |
| 4.4 小结 | 第64-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 附录a OfCHTⅢ的cDNA序列及编码氨基酸序列 | 第72-76页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
