| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第9-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-45页 |
| 1.1 脂肪酶概论 | 第15-19页 |
| 1.1.1 脂肪酶的结构 | 第15-17页 |
| 1.1.2 脂肪酶的在界面上的催化行为 | 第17-18页 |
| 1.1.3 脂肪酶的催化机理 | 第18-19页 |
| 1.2 脂肪酶的盖子结构 | 第19-26页 |
| 1.2.1 盖子结构的分类 | 第19-24页 |
| 1.2.2 盖子结构对界面激活的影响 | 第24-25页 |
| 1.2.3 盖子结构对水解活力和底物选择性的影响 | 第25页 |
| 1.2.4 盖子结构对热稳定性的影响 | 第25-26页 |
| 1.3 界面吸附的研究进展 | 第26-38页 |
| 1.3.1 单分子层的脂质分类 | 第27-28页 |
| 1.3.2 脂质单分子层在空气-水界面的相变图 | 第28-29页 |
| 1.3.3 单分子层技术原理 | 第29-30页 |
| 1.3.4 界面酶水解的动力学模型 | 第30-32页 |
| 1.3.5 只有一种底物存在的反应体系 | 第32-35页 |
| 1.3.6 混合底物存在的单分子层反应体系 | 第35-36页 |
| 1.3.7 脂肪酶在界面上的吸附行为 | 第36-38页 |
| 1.4 分子模拟 | 第38-42页 |
| 1.4.1 同源建模 | 第38-39页 |
| 1.4.2 分子对接 | 第39-42页 |
| 1.5 脂肪酶T1 | 第42-43页 |
| 1.5.1 脂肪酶T1的研究现状 | 第42页 |
| 1.5.2 脂肪酶T1的应用价值 | 第42-43页 |
| 1.6 研究背景、意义及研究内容 | 第43-45页 |
| 1.6.1 研究背景 | 第43页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第43-45页 |
| 第二章 脂肪酶T1的基因克隆、表达和纯化 | 第45-56页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第45-48页 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 | 第45-46页 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 | 第46页 |
| 2.1.3 缓冲液的制备 | 第46-48页 |
| 2.2 实验方法 | 第48-53页 |
| 2.2.1 脂肪酶T1基因序列的分析与合成 | 第48页 |
| 2.2.2 构建pET23a-CBD-T1载体 | 第48-50页 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备（氯化钙法） | 第50-51页 |
| 2.2.4 转化 | 第51页 |
| 2.2.5 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定 | 第51页 |
| 2.2.6 重组质粒表达菌株的构建 | 第51页 |
| 2.2.7 重组脂肪酶T1的表达 | 第51-52页 |
| 2.2.8 脂肪酶T1的纯化 | 第52-53页 |
| 2.2.9 蛋白质浓度的测定 | 第53页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第53-55页 |
| 2.3.1 脂肪酶T1基因序列合成与分析 | 第53-54页 |
| 2.3.2 脂肪酶T1表达与纯化 | 第54-55页 |
| 2.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第三章 建立单分子层技术测定脂肪酶底物选择性的方法 | 第56-66页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第56-58页 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 | 第56-57页 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 | 第57页 |
| 3.1.3 溶液的制备 | 第57-58页 |
| 3.1.4 酶的预处理 | 第58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-60页 |
| 3.2.1 单分子层技术的实验步骤 | 第58-59页 |
| 3.2.2 底物的表面压力-分子面积的曲线测定 | 第59页 |
| 3.2.3 基于单分子层法建立测定酶活力的方法 | 第59-60页 |
| 3.2.4 基于乳液法测定酶酶活 | 第60页 |
| 3.2.5 M-M方程动力学参数表征 | 第60页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第60-65页 |
| 3.3.1 基于LB单分子层的方法测定脂肪酶动力学 | 第60-63页 |
| 3.3.1.1 DOPC和Triolein的 Π-A等温曲线 | 第60-61页 |
| 3.3.1.2 在Triolein单分子层的水解动力学 | 第61-62页 |
| 3.3.1.3 在DOPC单分子层的水解动力学 | 第62-63页 |
| 3.3.2 基于乳液法测定的脂肪酶酶活 | 第63-64页 |
| 3.3.3 基于乳液法测定的磷脂酶酶活 | 第64-65页 |
| 3.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 脂肪酶T1结构分析和定点突变 | 第66-75页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第66-67页 |
| 4.1.1 主要材料与试剂 | 第66-67页 |
| 4.1.2 主要仪器和设备 | 第67页 |
| 4.2 实验方法 | 第67-70页 |
| 4.2.1 缓冲液的制备 | 第67-69页 |
| 4.2.2 培养基的制备 | 第69页 |
| 4.2.3 盖子区域的定点突变 | 第69-70页 |
| 4.2.4 突变体的表达和纯化 | 第70页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第70-74页 |
| 4.3.1 突变点的选择 | 第70-73页 |
| 4.3.2 突变体引物设计 | 第73页 |
| 4.3.3 突变体的表达和纯化 | 第73-74页 |
| 4.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 第五章 脂肪酶T1盖子区域突变体对界面吸附的影响 | 第75-87页 |
| 5.1 材料与仪器 | 第75-76页 |
| 5.1.1 主要材料与试剂 | 第75页 |
| 5.1.2 主要仪器和设备 | 第75-76页 |
| 5.1.3 缓冲液的制备 | 第76页 |
| 5.2 实验方法 | 第76-78页 |
| 5.2.1 最大插入表面压力的测定 | 第76页 |
| 5.2.2 Egg-PC的 Π-A曲线 | 第76页 |
| 5.2.3 突变体在界面压力随时间的变化 | 第76页 |
| 5.2.4 脂肪酶T1以及突变体在界面吸附性质表征 | 第76-78页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第78-86页 |
| 5.3.1 Egg-PC的表面压力与分子面积的 Π–A曲线 | 第78-79页 |
| 5.3.2 最大插入表面压力 | 第79-80页 |
| 5.3.3 脂肪酶以及突变体在界面压力随时间的变化的曲线 | 第80-81页 |
| 5.3.4 脂肪酶以及突变体在界面上吸附动力学 | 第81-82页 |
| 5.3.5 脂肪酶以及突变体在界面上吸附动力学参数 | 第82-83页 |
| 5.3.6 脂肪酶以及突变体在界面上吸附量及界面分子面积 | 第83-85页 |
| 5.3.7 脂肪酶T1的界面吸附模型 | 第85-86页 |
| 5.4 本章小结 | 第86-87页 |
| 第六章盖子区域疏水氨基酸影响脂肪酶T1水解活力机制 | 第87-98页 |
| 6.1 材料与仪器 | 第87-88页 |
| 6.1.1 主要材料与试剂 | 第87页 |
| 6.1.2 主要仪器和设备 | 第87-88页 |
| 6.1.3 缓冲液的制备 | 第88页 |
| 6.2 实验方法 | 第88-90页 |
| 6.2.1 人工底物测定水解酶活 | 第88-89页 |
| 6.2.2 蛋白浓度的测定 | 第89页 |
| 6.2.3 单分子层法测定脂肪酶T1的活力 | 第89-90页 |
| 6.2.4 构建脂肪酶T1的开放结构 | 第90页 |
| 6.2.5 构建脂肪酶T1与底物的复合物结构 | 第90页 |
| 6.2.6 脂肪酶T1与底物类似物的分子动力学模拟 | 第90页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第90-97页 |
| 6.3.1 对硝基苯酚的标准曲线 | 第90-91页 |
| 6.3.2 界面激活曲线 | 第91-92页 |
| 6.3.3 同源建模 | 第92-93页 |
| 6.3.4 脂肪酶T1与底物的分子对接 | 第93-96页 |
| 6.3.5 基于 1，2-二月桂酸甘油酯单分子膜上的脂肪酶活力测定 | 第96-97页 |
| 6.4 本章小结 | 第97-98页 |
| 结论与展望 | 第98-101页 |
| 1. 主要研究结论 | 第98-99页 |
| 2. 本论文的主要创新点 | 第99页 |
| 3. 对未来工作的展望 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-117页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第117-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 附件 | 第120页 |
