| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 PRRSV的研究进展 | 第11-17页 |
| 1.1.1 PRRSV的生物学背景及其所引起的疾病 | 第11-12页 |
| 1.1.2 PRRSV的基因组及其所表达的蛋白 | 第12-16页 |
| 1.1.3 NSP7蛋白的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2 蛋白结构的研究 | 第17-21页 |
| 1.2.1 研究蛋白结构的意义 | 第17页 |
| 1.2.2 蛋白质结构研究的主要手段 | 第17-18页 |
| 1.2.3 核磁共振基本理论 | 第18页 |
| 1.2.4 液体核磁共振解析蛋白质结构的基本步骤 | 第18-21页 |
| 1.3 蛋白质互作的研究方法 | 第21-22页 |
| 1.3.1 酵母双杂交系统 | 第21-22页 |
| 1.3.2 Pull-down | 第22页 |
| 1.3.3 双分子荧光互补(BiFC) | 第22页 |
| 1.4 研究内容和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 NSP7α 和NSP7β 在PRRSV感染的细胞中表达的检测 | 第23-38页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第23-25页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 病毒、细胞和实验动物 | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 | 第24页 |
| 2.1.4 溶液配方 | 第24-25页 |
| 2.2 实验仪器 | 第25页 |
| 2.3 方法 | 第25-29页 |
| 2.3.1 质粒构建和蛋白表达纯化 | 第25-27页 |
| 2.3.2 多克隆抗体的制备和检测 | 第27-28页 |
| 2.3.3 NSP7α 和NSP7β 及其前体蛋白在PRRSV感染的细胞中的表达 | 第28-29页 |
| 2.4 结果与分析 | 第29-35页 |
| 2.4.1 质粒构建、蛋白表达和纯化的结果 | 第29-32页 |
| 2.4.2 多克隆抗体的检测 | 第32-33页 |
| 2.4.3 PRRSV感染细胞的Western blot检测 | 第33-34页 |
| 2.4.4 PRRSV感染的细胞中NSP7α 和NSP7β 及其前体蛋白的分布 | 第34-35页 |
| 2.5 结论与讨论 | 第35-38页 |
| 2.5.1 多抗与单抗在实验中的比较 | 第35-36页 |
| 2.5.2 感染的细胞中目的蛋白的Western blot和免疫荧光检测 | 第36页 |
| 2.5.3 MARC-145 和PAMs细胞的检测效果 | 第36-38页 |
| 第三章 溶液中NSP7α 的NMR结构解析 | 第38-53页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第38-39页 |
| 3.1.1 质粒和菌株 | 第38页 |
| 3.1.2 主要试剂、试剂盒 | 第38页 |
| 3.1.3 溶液配方 | 第38-39页 |
| 3.2 主要仪器 | 第39页 |
| 3.3 方法 | 第39-41页 |
| 3.3.1 同位素 13C和 15N标记的NSP7α 的表达、纯化 | 第39页 |
| 3.3.2 应用TEV蛋白酶切除NSP7α 的N端HIS-tag | 第39-40页 |
| 3.3.3 NSP7α 蛋白样品超滤浓缩 | 第40页 |
| 3.3.4 获取NSP7α 的NMR谱并对NMR谱进行解析 | 第40页 |
| 3.3.5 NSP7α 三维结构的计算 | 第40-41页 |
| 3.3.6 基于NSP7α 蛋白结构分析NSP7α 的功能区域和表面电位 | 第41页 |
| 3.3.7 PRRSV NSP7α 与其同源蛋白EAV NSP7α 序列和结构的比对 | 第41页 |
| 3.4 结果与分析 | 第41-51页 |
| 3.4.1 NSP7α 的N端HIS-tag的切除 | 第41页 |
| 3.4.2 NSP7α NMR谱的解析结果 | 第41-45页 |
| 3.4.3 溶液中NSP7α 的三维结构 | 第45-49页 |
| 3.4.4 NSP7α 结构功能区域的分析 | 第49页 |
| 3.4.5 PRRSV NSP7α 与EAV NSP7α 序列比对 | 第49-51页 |
| 3.5 结论与讨论 | 第51-53页 |
| 第四章 NSP7α 与NSP9互作的研究 | 第53-62页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第53-54页 |
| 4.1.1 质粒、菌株、细胞和蛋白结构模型 | 第53页 |
| 4.1.2 主要试剂和试剂盒 | 第53页 |
| 4.1.3 主要溶液配方 | 第53-54页 |
| 4.2 主要仪器 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-56页 |
| 4.3.1 应用酵母双杂技术分析NSP7α 与PRRS病毒的其它非结构蛋白的互作情况 | 第54-55页 |
| 4.3.2 NSP7α 与NSP9的互作的Pull-down实验 | 第55页 |
| 4.3.3 应用BiFC技术验证NSP7α 与NSP9的互作 | 第55-56页 |
| 4.3.4 NSP7α 与NSP9互作位点的预测 | 第56页 |
| 4.3.5 NSP7α 与NSP9互作位点的验证 | 第56页 |
| 4.4 结果与分析 | 第56-61页 |
| 4.4.1 酵母双杂筛选结果 | 第56-57页 |
| 4.4.2 NSP7α 与NSP9互作的Pull-down验证结果 | 第57-58页 |
| 4.4.3 NSP7α 与NSP9互作的BiFC验证 | 第58页 |
| 4.4.4 NSP7α 与NSP9互作位点的预测结果 | 第58-59页 |
| 4.4.5 NSP7α 与NSP9互作位点的验证结果 | 第59-61页 |
| 4.5 结论与讨论 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 附录 | 第70-90页 |
| NSP7α 化学位移表 | 第70-89页 |
| 缩略词表 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 作者简介 | 第91页 |
