| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 1 前言 | 第14-27页 |
| 1.1 绿脓杆菌概述 | 第14页 |
| 1.2 绿脓杆菌的耐药性与致病性 | 第14-17页 |
| 1.2.1 绿脓杆菌的耐药性 | 第14-16页 |
| 1.2.2 绿脓杆菌的致病性 | 第16-17页 |
| 1.3 细菌的群体感应研究概况 | 第17-19页 |
| 1.4 绿脓杆菌的群体感应系统 | 第19-22页 |
| 1.4.1 las系统、rhl系统以及PQS信号系统 | 第19-20页 |
| 1.4.2 集成型群体感应信号系统 | 第20-22页 |
| 1.5 绿脓杆菌的其它调控机制 | 第22-26页 |
| 1.5.1 转录调控因子 | 第22-23页 |
| 1.5.2 双组分系统 | 第23-24页 |
| 1.5.3 c-di-GMP | 第24-26页 |
| 1.6 本课题研究的目的、意义 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-49页 |
| 2.1 菌株、质粒和培养条件 | 第27-28页 |
| 2.2 生化试剂、引物和其它材料 | 第28-29页 |
| 2.3 常用培养基、溶液和缓冲液 | 第29-30页 |
| 2.4 主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 2.5 Tn5插入突变体库的构建 | 第31-32页 |
| 2.5.1 双亲杂交 | 第31页 |
| 2.5.2 插入突变体的初筛与复筛 | 第31-32页 |
| 2.5.3 Tn5突变体的检测 | 第32页 |
| 2.6 hiTAIL-PCR扩增获得目的基因序列 | 第32-37页 |
| 2.6.1 hiTAIL-PCR反应 | 第32-35页 |
| 2.6.2 目的片段的回收 | 第35-36页 |
| 2.6.3 PCR产物的连接反应 | 第36页 |
| 2.6.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.6.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第36-37页 |
| 2.6.6 阳性重组转化子的鉴定 | 第37页 |
| 2.6.7 Tn5插入区侧翼序列分析 | 第37页 |
| 2.7 分子生物学和生物信息学方法分析、鉴定目的基因 | 第37页 |
| 2.8 PA3192、PA3271及PA4596敲除突变体的获得 | 第37-40页 |
| 2.8.1 PCR扩增目的基因两端同源臂 | 第37-38页 |
| 2.8.2 融合PCR获取缺失目的基因的融合片段 | 第38页 |
| 2.8.3 质粒Pk18-Gm与融合片段的双酶切 | 第38-39页 |
| 2.8.4 融合片段与克隆载体的连接 | 第39页 |
| 2.8.5 连接产物的转化 | 第39页 |
| 2.8.6 阳性克隆筛选及重组质粒验证 | 第39-40页 |
| 2.8.7 三亲杂交和筛选、验证突变体 | 第40页 |
| 2.9 突变基因的功能互补 | 第40-43页 |
| 2.9.1 细菌基因组总DNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.9.2 互补目的基因PCR反应 | 第41页 |
| 2.9.3 PCR产物的检测 | 第41页 |
| 2.9.4 PCR扩增产物的纯化和回收 | 第41页 |
| 2.9.5 互补片段双酶切 | 第41页 |
| 2.9.6 回收酶切的目的DNA片段 | 第41页 |
| 2.9.7 pUCP18互补质粒DNA碱裂解法提取 | 第41-42页 |
| 2.9.8 互补质粒pUCP18的双酶切 | 第42页 |
| 2.9.9 回收酶切的互补质粒片段 | 第42页 |
| 2.9.10 目的片段与互补质粒的连接 | 第42页 |
| 2.9.11 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| 2.9.12 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第43页 |
| 2.9.13 重组质粒扩增及菌液PCR鉴定 | 第43页 |
| 2.10 互补体的获得 | 第43-44页 |
| 2.10.1 绿脓杆菌感受态细胞快速制备 | 第43页 |
| 2.10.2 电转化 | 第43页 |
| 2.10.3 互补体的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 2.11 突变的基因表达及调控分析 | 第44-47页 |
| 2.11.1 细菌RNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.11.2 总RNA的纯度和完整性检测 | 第45页 |
| 2.11.3 反转录反应 | 第45-46页 |
| 2.11.4 进行qRT-PCR | 第46-47页 |
| 2.12 绿脓菌素的测定 | 第47页 |
| 2.13 细菌的运动能力实验 | 第47-48页 |
| 2.13.1 运动性（Swimming motility）实验 | 第47-48页 |
| 2.13.2 群集性（Swarmming motility）实验 | 第48页 |
| 2.14 生物被膜的测定 | 第48页 |
| 2.15 弹性蛋白酶测定 | 第48页 |
| 2.16 线虫接种实验 | 第48-49页 |
| 2.17 上清液萃取及HPLC | 第49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-71页 |
| 3.1 低磷条件下绿脓毒素表达调控相关基因的筛选 | 第49-55页 |
| 3.1.1 Tn5插入突变体库的构建与筛选 | 第49-50页 |
| 3.1.2 Tn5突变体的PCR检测 | 第50页 |
| 3.1.3 突变体插入位点和插入基因的确定 | 第50-51页 |
| 3.1.4 阳性重组转化子的鉴定 | 第51-52页 |
| 3.1.5 Tn5转座子侧翼序列比对与生物信息学分析 | 第52-55页 |
| 3.2 插入突变体的互补 | 第55-56页 |
| 3.2.1 目的片段与互补质粒的获得以及重组质粒的鉴定 | 第55页 |
| 3.2.2 互补体的筛选 | 第55-56页 |
| 3.3 插入突变体与互补体表型的确定 | 第56-60页 |
| 3.3.1 绿脓毒素测定 | 第56页 |
| 3.3.2 生物被膜测定 | 第56-57页 |
| 3.3.3 弹性蛋白酶测定 | 第57-58页 |
| 3.3.4 运动性实验 | 第58-59页 |
| 3.3.5 线虫接种实验 | 第59-60页 |
| 3.4 基因PA5295与IQS信号系统以及下游毒力因子调节作用的研究 | 第60-61页 |
| 3.4.1 细菌RNA的电泳检测 | 第60-61页 |
| 3.4.2 RT-qPCR定量分析 | 第61页 |
| 3.5 IQS信号系统调控基因的生物信息学分析预测 | 第61-62页 |
| 3.6 PA3192、PA3271及PA4596的敲除与互补实验 | 第62-64页 |
| 3.6.1 基因敲除实验 | 第62-63页 |
| 3.6.2 敲除突变体功能互补实验 | 第63-64页 |
| 3.7 敲除突变体与互补体的表型与毒力测定 | 第64-70页 |
| 3.7.1 游动性（Swimming）实验 | 第64-65页 |
| 3.7.2 群集性（Swarmming）实验 | 第65-66页 |
| 3.7.3 绿脓毒素测定 | 第66-67页 |
| 3.7.4 生物被膜测定 | 第67页 |
| 3.7.5 突变体上清萃取及HPLC检测 | 第67-69页 |
| 3.7.6 弹性蛋白酶测定 | 第69页 |
| 3.7.7 线虫接种实验 | 第69-70页 |
| 3.8 PA3192、PA3271及PA4596对QS系统相关基因的调节作用 | 第70-71页 |
| 4 结论与讨论 | 第71-76页 |
| 4.1 结论 | 第71-72页 |
| 4.2 讨论 | 第72-76页 |
| 4.2.1 在绿脓杆菌中运用Tn5转座子插入突变进行调控基因的筛选 | 第72-73页 |
| 4.2.2 c-di-GMP与群体感应系统的关系 | 第73页 |
| 4.2.3 集成型群体感应系统调控网络的完善 | 第73-75页 |
| 4.2.4 存在的问题及有待深入研究的内容 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-83页 |
| 附录 | 第83-84页 |
