| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第12-14页 |
| 第一章 引言 | 第14-28页 |
| 1.1 犬乳腺肿瘤研究进展 | 第14-17页 |
| 1.1.1 乳腺的解剖结构 | 第14页 |
| 1.1.2 乳腺肿瘤流行病学 | 第14-15页 |
| 1.1.3 乳腺肿瘤的分类 | 第15页 |
| 1.1.4 乳腺肿瘤风险因素 | 第15-16页 |
| 1.1.5 临床症状与诊断 | 第16页 |
| 1.1.6 乳腺肿瘤治疗方法 | 第16-17页 |
| 1.2 常用化疗药物的分类及作用机制 | 第17-18页 |
| 1.2.1 烷化剂类 | 第17页 |
| 1.2.2 抗代谢药物 | 第17-18页 |
| 1.2.3 细胞毒素类抗生素 | 第18页 |
| 1.2.4 植物生物碱和其他天然药物 | 第18页 |
| 1.2.5 激素类化疗药物 | 第18页 |
| 1.2.6 其他抗肿瘤药物 | 第18页 |
| 1.3 肿瘤细胞耐药机制 | 第18-22页 |
| 1.3.1 药理学机制 | 第19页 |
| 1.3.2 药物外排作用的增加 | 第19-20页 |
| 1.3.3 药物在肿瘤细胞内失活 | 第20页 |
| 1.3.4 药物作用靶点的改变 | 第20-21页 |
| 1.3.5 细胞周期的改变 | 第21页 |
| 1.3.6 DNA损伤修复能力增加 | 第21页 |
| 1.3.7 缺氧环境 | 第21页 |
| 1.3.8 Wnt通路过度激活 | 第21-22页 |
| 1.3.9 其他机制等 | 第22页 |
| 1.4 肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs) | 第22-23页 |
| 1.5 上皮间质转移(epithelial-mesenchymal transition, EMT) | 第23-24页 |
| 1.6 Notch通路 | 第24-25页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第25-27页 |
| 1.8 研究技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 耐5-FU犬乳腺肿瘤细胞系的建立 | 第28-47页 |
| 前言 | 第28页 |
| 2.1 材料 | 第28-31页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第28-30页 |
| 2.1.2 主要仪器与材料 | 第30-31页 |
| 2.2 方法 | 第31-36页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第31页 |
| 2.2.2 5-FU对于CMT7364细胞系的半数致死浓度 | 第31-32页 |
| 2.2.3 浓度梯度法建立耐5-FU犬乳腺肿瘤细胞系 | 第32页 |
| 2.2.4 细胞形态学比较 | 第32页 |
| 2.2.5 生长曲线比较 | 第32-33页 |
| 2.2.6 交叉耐药性比较 | 第33页 |
| 2.2.7 耐药蛋白western blotting分析 | 第33-35页 |
| 2.2.8 免疫荧光定位耐药蛋白分布 | 第35页 |
| 2.2.9 异种移植模型分析体内耐药性 | 第35-36页 |
| 2.3 结果 | 第36-44页 |
| 2.3.1 细胞传代稳定 | 第36页 |
| 2.3.2 5-FU对于CMT7364的细胞毒性 | 第36页 |
| 2.3.3 耐5-FU犬乳腺肿瘤细胞系建立成功 | 第36页 |
| 2.3.4 耐药细胞与亲代敏感细胞形态存在差异 | 第36-37页 |
| 2.3.5 耐药细胞群体倍增时间更长 | 第37-38页 |
| 2.3.6 耐药细胞会对其他化疗药物产生交叉耐药性 | 第38-39页 |
| 2.3.7 耐药蛋白ABCB1及ABCG2过度表达 | 第39-40页 |
| 2.3.8 免疫荧光定位耐药蛋白 | 第40-42页 |
| 2.3.9 耐药细胞在体内也存在耐药性 | 第42-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-46页 |
| 小结 | 第46-47页 |
| 第三章 异种移植模型化疗后犬乳腺肿瘤细胞的原代培养 | 第47-58页 |
| 前言 | 第47-48页 |
| 3.1 材料 | 第48-49页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第48页 |
| 3.1.2 主要仪器与材料 | 第48-49页 |
| 3.2 方法 | 第49-51页 |
| 3.2.1 原代培养 | 第49-50页 |
| 3.2.2 细胞纯化 | 第50页 |
| 3.2.3 染色体核型分析 | 第50-51页 |
| 3.2.4 形态学观察 | 第51页 |
| 3.2.5 耐药性对比 | 第51页 |
| 3.2.6 生长曲线比较 | 第51页 |
| 3.3 结果 | 第51-55页 |
| 3.3.1 经原代培养细胞形态差别较大 | 第51页 |
| 3.3.2 细胞经两次纯化后细胞形态较均匀 | 第51-52页 |
| 3.3.3 纯化后细胞染色体数目较统一 | 第52-53页 |
| 3.3.4 纯化前后形态学比较 | 第53-54页 |
| 3.3.5 耐药性分析 | 第54-55页 |
| 3.3.6 纯化后细胞增殖特点类似于耐药细胞 | 第55页 |
| 3.4 讨论 | 第55-57页 |
| 小结 | 第57-58页 |
| 第四章 细胞耐药性与肿瘤干细胞的关系 | 第58-79页 |
| 前言 | 第58-59页 |
| 4.1 材料 | 第59-61页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第59-60页 |
| 4.1.2 仪器与材料 | 第60-61页 |
| 4.2 方法 | 第61-64页 |
| 4.2.1 流式细胞技术分析耐药细胞干性 | 第61页 |
| 4.2.2 低粘附无血清悬浮培养观察乳球形成能力 | 第61-62页 |
| 4.2.3 平板克隆形成试验分析 | 第62页 |
| 4.2.4 Western blotting分析Wnt信号通路及ALDH表达情况 | 第62页 |
| 4.2.5 耐药细胞与亲代敏感细胞成瘤能力比较 | 第62-63页 |
| 4.2.6 细胞迁移试验 | 第63页 |
| 4.2.7 细胞侵袭试验(基质胶) | 第63页 |
| 4.2.8 EMT相关蛋白表达分析 | 第63-64页 |
| 4.2.9 异种移植分析远端肺转移 | 第64页 |
| 4.3 结果 | 第64-77页 |
| 4.3.1 CD24~-/CD44~+细胞亚群比例在耐药细胞中更高 | 第64-65页 |
| 4.3.2 耐药细胞乳球形成能力更强 | 第65-67页 |
| 4.3.3 耐药细胞平板克隆能力更强 | 第67-68页 |
| 4.3.4 干细胞相关通路蛋白存在高表达 | 第68-69页 |
| 4.3.5 耐药细胞体内成瘤能力更强 | 第69-74页 |
| 4.3.5.1 划痕修复试验表明耐药细胞迁移能力更强 | 第71-73页 |
| 4.3.5.2 Transwell小室试验表明耐药细胞迁移能力更强 | 第73-74页 |
| 4.3.6 Transwell小室分析表明耐药细胞穿透基质胶的侵袭能力更强 | 第74-75页 |
| 4.3.7 EMT相关蛋白出现过表达 | 第75页 |
| 4.3.8 体内试验表明耐药细胞更容易发生肺转移 | 第75-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-78页 |
| 小结 | 第78-79页 |
| 第五章 耐药细胞中Notch1通路的变化 | 第79-97页 |
| 前言 | 第79-80页 |
| 5.1 材料 | 第80-82页 |
| 5.1.1 实验试剂 | 第80-81页 |
| 5.1.2 仪器与材料 | 第81-82页 |
| 5.2 方法 | 第82-86页 |
| 5.2.1 Notch1基因的表达变化 | 第82-83页 |
| 5.2.2 Notch1蛋白表达变化 | 第83页 |
| 5.2.3 DAPT对细胞的毒性与时间的关系 | 第83-84页 |
| 5.2.4 DAPT处理后化疗敏感性测试 | 第84页 |
| 5.2.5 DAPT处理后Notch1蛋白表达情况 | 第84页 |
| 5.2.6 DAPT对细胞迁移作用的影响 | 第84-85页 |
| 5.2.7 DAPT处理后对干细胞性的影响 | 第85-86页 |
| 5.3 结果 | 第86-95页 |
| 5.3.1 Notch1基因mRNA在耐药细胞出现上调 | 第86页 |
| 5.3.2 Notch1胞内区蛋白在耐药细胞中会上调 | 第86-87页 |
| 5.3.3 不同浓度DAPT对细胞活率会产生不同的抑制效果 | 第87-88页 |
| 5.3.4 DAPT可以增加化疗敏感性 | 第88页 |
| 5.3.5 DAPT可以干扰Notch1蛋白胞内区的表达 | 第88-89页 |
| 5.3.6 DAPT处理后对转移的影响 | 第89-92页 |
| 5.3.7 DAPT处理后对干细胞化的影响 | 第92-95页 |
| 5.4 讨论 | 第95-96页 |
| 小结 | 第96-97页 |
| 第六章 结论与创新点 | 第97-98页 |
| 6.1 结论 | 第97页 |
| 6.2 创新点 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-112页 |
| 致谢 | 第112-114页 |
| 个人简介 | 第114页 |
