| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第1章 绪论 | 第15-23页 |
| 1.1 选题意义 | 第15-17页 |
| 1.2 研究现状 | 第17-21页 |
| 1.2.1 淀粉酶分类及其应用 | 第17-18页 |
| 1.2.2 真菌α-淀粉酶的结构及其催化机制 | 第18-20页 |
| 1.2.3 真菌α-淀粉酶产麦芽糖的研究现状 | 第20页 |
| 1.2.4 真菌α-淀粉酶的研究方法 | 第20-21页 |
| 1.3 研究目的及内容 | 第21-23页 |
| 1.3.1 研究目的 | 第21页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 米根霉α-淀粉酶分子对接及突变体分析 | 第23-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 实验材料 | 第23页 |
| 2.1.3 培养基 | 第23-24页 |
| 2.1.4 仪器与设备 | 第24页 |
| 2.1.5 ROAmy分子建模与定点突变 | 第24页 |
| 2.1.6 突变表达菌株的构建及发酵 | 第24-25页 |
| 2.1.7 酶活测定 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-30页 |
| 2.2.1 突变位点的确定 | 第25-26页 |
| 2.2.2 重叠PCR引物的设计 | 第26页 |
| 2.2.3 DNA产物纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组质粒构建 | 第27-28页 |
| 2.2.5 重组菌的构建 | 第28页 |
| 2.2.6 重组菌的挑选与验证 | 第28页 |
| 2.2.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第28页 |
| 2.2.8 10L发酵罐放大实验 | 第28-29页 |
| 2.2.9 重组蛋白的分离及纯化 | 第29页 |
| 2.2.10 SDS-PAGE凝胶的制备及电泳 | 第29页 |
| 2.2.11 ROAmy与突变体的酶学性质分析 | 第29-30页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第30-39页 |
| 2.3.1 ROAmy 3 D结构分析及与麦芽三糖对接 | 第30-31页 |
| 2.3.2 突变体3D模型的构建 | 第31页 |
| 2.3.3 重叠PCR | 第31-32页 |
| 2.3.4 pPIC9k-ROA重组菌活性验证 | 第32页 |
| 2.3.5 10 L发酵罐发酵过程 | 第32-33页 |
| 2.3.6 重组蛋白的分离及纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.7 ROAmy与突变体酶学性质 | 第34-36页 |
| 2.3.8 ROAmy与突变体作用于淀粉及麦芽三糖终产物分析 | 第36-37页 |
| 2.3.9 结合对接模型及水解终产物分析 | 第37-39页 |
| 2.4 小结 | 第39-40页 |
| 第3章 米根霉α-淀粉酶催化区域组氨酸突变及分析 | 第40-49页 |
| 3.1 材料与仪器 | 第40页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第40页 |
| 3.1.2 酶与试剂 | 第40页 |
| 3.1.3 培养基 | 第40页 |
| 3.1.4 仪器与设备 | 第40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-43页 |
| 3.2.1 突变位点的确定 | 第40-41页 |
| 3.2.2 重叠PCR引物的设计 | 第41-42页 |
| 3.2.3 DNA产物纯化 | 第42-43页 |
| 3.2.4 突变质粒的构建 | 第43页 |
| 3.2.5 突变体的构建 | 第43页 |
| 3.2.6 10L发酵罐放大实验 | 第43页 |
| 3.2.7 重组蛋白的分离及纯化 | 第43页 |
| 3.2.8 ROAmy与突变体的酶学性质分析 | 第43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-48页 |
| 3.3.1 米根霉α-淀粉酶催化区域组氨酸突变体分析 | 第43-44页 |
| 3.3.2 突变体H120L、H78L及H200L水解终产物分析 | 第44-45页 |
| 3.3.3 ROAmy与286饱和突变体水解终产物分析 | 第45-47页 |
| 3.3.4 结合对接模型及水解终产物分析 | 第47-48页 |
| 3.4 小结 | 第48-49页 |
| 第4章 米根霉α-淀粉酶保守区域氨基酸突变及分析 | 第49-56页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第49页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第49页 |
| 4.1.2 酶与试剂 | 第49页 |
| 4.1.3 培养基 | 第49页 |
| 4.1.4 仪器与设备 | 第49页 |
| 4.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 突变位点的确定 | 第49-50页 |
| 4.2.2 重叠PCR引物的设计 | 第50页 |
| 4.2.3 DNA产物纯化 | 第50-51页 |
| 4.2.4 突变质粒的构建 | 第51页 |
| 4.2.5 突变体的构建 | 第51页 |
| 4.2.6 10L发酵罐放大实验 | 第51页 |
| 4.2.7 重组蛋白的分离及纯化 | 第51页 |
| 4.2.8 ROAmy与突变体的酶学性质分析 | 第51页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第51-54页 |
| 4.3.1 米根霉α-淀粉酶保守区域突变体分析 | 第51-52页 |
| 4.3.2 ROAmy与突变体水解终产物分析 | 第52-53页 |
| 4.3.3 结合对接模型及水解终产物分析 | 第53-54页 |
| 4.4 小结 | 第54-56页 |
| 第5章 结论与展望 | 第56-58页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-66页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
