| 中文摘要 | 第1-21页 |
| Abstract | 第21-27页 |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 | 第27-74页 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 | 第27-45页 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 | 第27-34页 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 | 第27页 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 | 第27-28页 |
| ·核酸疫苗的组成 | 第27-28页 |
| ·核酸疫苗的分类 | 第28页 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 | 第28-31页 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 | 第31-32页 |
| ·核酸疫苗的优点 | 第31-32页 |
| ·核酸疫苗的不足 | 第32页 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 | 第32-34页 |
| ·目的基因的选择 | 第33页 |
| ·载体及启动子的选择 | 第33页 |
| ·增强剂和佐剂的应用 | 第33页 |
| ·接种途径和剂量 | 第33-34页 |
| ·接种前动物组织的预处理 | 第34页 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 | 第34-45页 |
| 1、分子佐剂的应用 | 第34-41页 |
| ·细胞因子基因佐剂 | 第35-36页 |
| ·共刺激分子 | 第36-37页 |
| ·补体佐剂 | 第37-38页 |
| ·免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） | 第38页 |
| ·霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） | 第38页 |
| ·蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） | 第38-39页 |
| ·模拟或增强MHC 作用 | 第39页 |
| ·提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 | 第39-40页 |
| ·提高抗原处理能力 | 第40页 |
| ·双作用子的应用 | 第40-41页 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 | 第41页 |
| 3、载体的优化及选择 | 第41-43页 |
| ·质粒载体 | 第41-42页 |
| ·细菌载体 | 第42-43页 |
| ·病毒载体 | 第43页 |
| 4、免疫方案的优化 | 第43-45页 |
| ·免疫途径 | 第43-44页 |
| ·免疫工具的选择 | 第44-45页 |
| ·免疫程序及组合免疫 | 第45页 |
| 5、展望 | 第45页 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 | 第45-74页 |
| （三） 补体系统概述 | 第45-54页 |
| 1、补体成分的分类 | 第46-51页 |
| ·补体系统的固有成分 | 第46-48页 |
| ·补体系统的调节因子 | 第48-50页 |
| ·补体受体 | 第50-51页 |
| ·补体活性片段 | 第51页 |
| 2、补体系统的激活 | 第51-54页 |
| ·经典激活途径 | 第52-53页 |
| ·替代途径 | 第53-54页 |
| ·凝集素途径 | 第54页 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 | 第54-62页 |
| 1、分子特征 | 第55-59页 |
| ·C3d 分子 | 第55页 |
| ·CR2(CD21 分子) | 第55-57页 |
| ·CR2-C3d 结合的结构特征 | 第57-59页 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 | 第59-62页 |
| ·C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 | 第60页 |
| ·C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 | 第60-61页 |
| ·C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 | 第61-62页 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 | 第62-72页 |
| 1、分子佐剂的应用 | 第63-64页 |
| 2、C3d 的分子结构 | 第64-66页 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 | 第66-70页 |
| ·C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 | 第66-67页 |
| ·C3d 可以增强基因免疫效果 | 第67页 |
| ·C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 | 第67页 |
| ·C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 | 第67-68页 |
| ·C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 | 第68页 |
| ·C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 | 第68-69页 |
| ·C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 | 第69页 |
| ·C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 | 第69-70页 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 | 第70-72页 |
| ·C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 | 第70页 |
| ·C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 | 第70-71页 |
| ·C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 | 第71页 |
| ·分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 | 第71-72页 |
| ·C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 | 第72页 |
| （六） 本研究的目的及意义 | 第72-74页 |
| 第二部分 试验研究部分 | 第74-231页 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 | 第74-112页 |
| 1 材料和方法 | 第75-83页 |
| ·材料 | 第75-77页 |
| ·菌株 | 第75页 |
| ·载体 | 第75页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第75页 |
| ·试验动物 | 第75-76页 |
| ·主要仪器 | 第76页 |
| ·试验所用溶液及其配制 | 第76-77页 |
| ·RT-PCR 相关物品的处理 | 第77页 |
| ·方法 | 第77-83页 |
| ·肝脏总RNA 的提取 | 第77-78页 |
| ·引物设计 | 第78页 |
| ·RT- PCR 扩增C3d cDNA | 第78-79页 |
| ·制作感受态细胞 | 第79-80页 |
| ·PCR 产物与pMD18-T 的连接 | 第80页 |
| ·连接物的转化 | 第80页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第80-82页 |
| ·测序 | 第82页 |
| ·补体C3d 基因序列分析 | 第82页 |
| ·补体C3d 基因蛋白质结构分析 | 第82-83页 |
| 2 结果 | 第83-109页 |
| ·RT-PCR 扩增C3d cDNA | 第83页 |
| ·pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 | 第83-84页 |
| ·补体C3d cDNA 的测序及序列分析 | 第84-89页 |
| ·测序结果递交GenBank | 第84-85页 |
| ·利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 | 第85-88页 |
| ·DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 | 第88-89页 |
| ·蛋白序列结构及功能特征预测 | 第89-109页 |
| ·ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 | 第89-90页 |
| ·ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 | 第90-102页 |
| ·补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 | 第102页 |
| ·补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 | 第102-109页 |
| 3 讨论 | 第109-112页 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 | 第112-143页 |
| 1 材料与方法 | 第113-127页 |
| ·材料 | 第113-117页 |
| ·载体与受体菌 | 第113页 |
| ·试验动物 | 第113页 |
| ·试剂 | 第113-114页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 | 第114-115页 |
| ·包涵体纯化的有关试剂 | 第115-116页 |
| ·免疫转印有关试剂和材料 | 第116页 |
| ·仪器 | 第116-117页 |
| ·方法 | 第117-127页 |
| ·鸡肝脏总RNA 的提取 | 第117页 |
| ·RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 | 第117-118页 |
| ·C3d 原核表达载体的构建 | 第118-120页 |
| ·重组质粒的提取与初步筛选 | 第120-121页 |
| ·pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第121页 |
| ·重组菌表达条件的优化 | 第121-122页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第122-123页 |
| ·表达产物的Western-blotting 检测 | 第123-124页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第124-127页 |
| 2 结果 | 第127-135页 |
| ·C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 | 第127-128页 |
| ·pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 | 第128-130页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第130-131页 |
| ·IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 | 第131-132页 |
| ·IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 | 第132页 |
| ·目的蛋白的表达量分析 | 第132页 |
| ·Western-Blotting 结果 | 第132-133页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第133-135页 |
| ·硫酸铵盐析 | 第133-134页 |
| ·Sephadex G-200 凝胶过滤层析 | 第134页 |
| ·蛋白质纯度的鉴定 | 第134-135页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第135页 |
| 3 讨论 | 第135-143页 |
| ·重组C3d 原核表达系统的选择 | 第135-136页 |
| ·重组C3d 目的蛋白的表达 | 第136-138页 |
| ·重组C3d 目的蛋白的复性 | 第138-139页 |
| ·重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 | 第139-140页 |
| ·重组C3d 目的蛋白的分离提纯 | 第140-143页 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 | 第143-151页 |
| 1 材料和方法 | 第144-147页 |
| ·材料 | 第144-145页 |
| ·抗C3d 21 肽抗体 | 第144页 |
| ·SPF 鸡血清及SPF 鸡 | 第144页 |
| ·菌株 | 第144-145页 |
| ·新西兰白兔 | 第145页 |
| ·1%致敏绵羊红细胞 | 第145页 |
| ·主要试剂 | 第145页 |
| ·C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 | 第145-146页 |
| ·重组C3d 蛋白的分离纯化 | 第145页 |
| ·大肠杆菌抗原的制备 | 第145-146页 |
| ·C3d 与大肠杆菌抗原的连接 | 第146页 |
| ·C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 | 第146-147页 |
| ·动物试验免疫方案 | 第146页 |
| ·抗体效价的检测（间接ELISA 方法） | 第146-147页 |
| ·总补体活性测定（微量板溶血法） | 第147页 |
| 2 结果 | 第147-149页 |
| ·不同佐剂疫苗的效果比较 | 第147-148页 |
| ·疫苗注射对补体总活性的影响 | 第148-149页 |
| 3 讨论 | 第149-151页 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 | 第151-164页 |
| 1 材料与方法 | 第152-156页 |
| ·材料 | 第152-153页 |
| ·新城疫油乳剂灭活苗 | 第152页 |
| ·重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 | 第152页 |
| ·血清和抗原 | 第152页 |
| ·攻毒用新城疫病毒 | 第152-153页 |
| ·实验用鸡 | 第153页 |
| ·主要试剂及其配制 | 第153页 |
| ·方法 | 第153-156页 |
| ·重组C3d 蛋白的纯化制备 | 第153页 |
| ·试验动物分组免疫及样品采集 | 第153-154页 |
| ·血清HI 抗体的检测 | 第154-155页 |
| ·淋巴细胞增殖试验（MTT 法） | 第155-156页 |
| ·攻毒保护试验 | 第156页 |
| ·数据处理 | 第156页 |
| 2 结果 | 第156-160页 |
| ·三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 | 第156-157页 |
| ·三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 | 第157-159页 |
| ·三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 | 第159-160页 |
| ·攻毒保护试验结果 | 第160页 |
| 3 讨论 | 第160-164页 |
| ·C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） | 第160-161页 |
| ·重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 | 第161-162页 |
| ·重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 | 第162-164页 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 | 第164-184页 |
| 1 材料和方法 | 第165-177页 |
| ·试验材料及仪器设备 | 第165-166页 |
| ·试验材料 | 第165-166页 |
| ·主要仪器 | 第166页 |
| ·方法 | 第166-177页 |
| ·P29 串联体的构建 | 第166-169页 |
| ·pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 | 第169-171页 |
| ·RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 | 第171-173页 |
| ·插入抗原基因 | 第173-175页 |
| ·重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) | 第175-177页 |
| 2 结果 | 第177-180页 |
| ·新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 | 第177页 |
| ·构建P29 串联体 | 第177-179页 |
| ·单拷贝P29 基因克隆 | 第177-178页 |
| ·P29 串联体的构建 | 第178-179页 |
| ·RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 | 第179页 |
| ·抗原基因的插入 | 第179-180页 |
| ·转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 | 第180页 |
| 3 讨论 | 第180-184页 |
| ·DNA 疫苗佐剂研究的意义 | 第180-181页 |
| ·抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 | 第181-182页 |
| ·脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 | 第182-184页 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 | 第184-200页 |
| 1 材料与方法 | 第185-191页 |
| ·材料 | 第185-186页 |
| ·主要仪器设备 | 第185页 |
| ·主要试剂 | 第185-186页 |
| ·主要材料 | 第186页 |
| ·方法 | 第186-191页 |
| ·试验动物分组及免疫注射 | 第186-187页 |
| ·不同试验组鸡血清补体总活性的测定 | 第187-188页 |
| ·各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） | 第188页 |
| ·抗鸡C3 21 肽抗体的制备 | 第188-189页 |
| ·抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 | 第189-190页 |
| ·C3 含量标准曲线的绘制 | 第190-191页 |
| ·各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 | 第191页 |
| 2 结果与分析 | 第191-194页 |
| ·各试验组鸡血清中补体总活性 | 第191-192页 |
| ·溶血素效价的测定 | 第191页 |
| ·各试验组鸡血清中补体总活性的测定 | 第191-192页 |
| ·兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 | 第192页 |
| ·溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 | 第192-193页 |
| ·各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 | 第193-194页 |
| 3. 讨论 | 第194-200页 |
| ·微量板溶血法测定动物血清补体的效价 | 第194页 |
| ·影响补体效价测定的因素 | 第194-196页 |
| ·补体总活性与动物的抗病力 | 第196-197页 |
| ·C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 | 第197-198页 |
| ·补体C3 与动物的抗病力 | 第198-200页 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 | 第200-231页 |
| 1 材料和方法 | 第201-213页 |
| ·材料 | 第201-205页 |
| ·常用试剂配制 | 第201-203页 |
| ·制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 | 第203页 |
| ·新城疫油乳剂灭活苗的制备 | 第203页 |
| ·ELISA 常用试剂 | 第203-204页 |
| ·主要仪器设备 | 第204-205页 |
| ·方法 | 第205-213页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第205页 |
| ·质粒的安全性检验 | 第205-206页 |
| ·质粒疫苗的体液免疫效果检测 | 第206-208页 |
| ·攻毒保护试验 | 第208-209页 |
| ·病毒排放的检测 | 第209页 |
| ·解剖检查 | 第209页 |
| ·重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 | 第209-211页 |
| ·重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 | 第211-213页 |
| 2 结果 | 第213-220页 |
| ·安全性检验结果 | 第213页 |
| ·血凝抑制抗体变化 | 第213页 |
| ·间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 | 第213-214页 |
| ·NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 | 第214-216页 |
| ·攻毒保护试验结果 | 第216-217页 |
| ·免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 | 第217-218页 |
| ·重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 | 第218-219页 |
| ·pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 | 第219-220页 |
| 3 讨论 | 第220-231页 |
| ·新城疫核酸疫苗研究的意义 | 第220-222页 |
| ·疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 | 第222-224页 |
| ·采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 | 第224-225页 |
| ·本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 | 第225-226页 |
| ·C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 | 第226-228页 |
| ·C3d 分子佐剂作用的可能机制 | 第228-231页 |
| 结论 | 第231-233页 |
| 参考文献 | 第233-259页 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 | 第259-262页 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 | 第262-263页 |
| 致谢 | 第263-264页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第264页 |
