| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-50页 |
| ·引言 | 第16-17页 |
| ·酶分子体外定向进化研究进展 | 第17-27页 |
| ·酶体外定向进化常用方法 | 第17-23页 |
| ·易错PCR技术 | 第18页 |
| ·饱和定点突变 | 第18-19页 |
| ·DNA改组 | 第19-20页 |
| ·随机引导重组 | 第20-21页 |
| ·交错延伸技术 | 第21-22页 |
| ·过渡模板随机嵌合生长 | 第22-23页 |
| ·随机插入/缺失链互换突变 | 第23页 |
| ·突变体文库筛选技术 | 第23-24页 |
| ·酶分子体外定向进化的应用 | 第24-27页 |
| ·提高酶的催化活性和稳定性 | 第25页 |
| ·对酶进行改造以适应恶劣的人工环境 | 第25页 |
| ·改变酶的催化专一性 | 第25-26页 |
| ·创造新的酶活性 | 第26-27页 |
| ·细胞色素P450及其研究现状 | 第27-35页 |
| ·细胞色素P450分布与特征 | 第27页 |
| ·细胞色素P450催化反应类型和机制 | 第27-28页 |
| ·细胞色素P450 BM-3 | 第28-35页 |
| ·细胞色素P450 BM-3催化反应 | 第29-30页 |
| ·定向进化技术在P450 BM-3研究中的应用 | 第30-34页 |
| ·细胞色素P450 BM-3的应用前景 | 第34-35页 |
| ·生产靛蓝的方法 | 第35-38页 |
| ·植物提取 | 第35-36页 |
| ·化学法合成靛蓝 | 第36-37页 |
| ·生物法合成靛蓝 | 第37-38页 |
| ·细胞色素P450催化苯乙烯的研究进展 | 第38页 |
| ·本课题的研究思路和目标 | 第38-40页 |
| 参考文献 | 第40-50页 |
| 第二章 易错PCR定向进化细胞色素P450 BM-3 | 第50-83页 |
| ·引言 | 第50-51页 |
| ·材料与方法 | 第51-61页 |
| ·试剂与材料 | 第51-52页 |
| ·宿主菌和质粒 | 第51-52页 |
| ·工具酶 | 第52页 |
| ·化学试剂 | 第52页 |
| ·培养基 | 第52-53页 |
| ·主要实验仪器 | 第53-54页 |
| ·实验方法 | 第54-61页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第54页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·高通量筛选方法的选择和优化 | 第54-55页 |
| ·定点突变实验设计 | 第55-56页 |
| ·易错PCR定向进化 | 第56-58页 |
| ·P450 BM-3的表达 | 第58-59页 |
| ·P450 BM-3的超声破碎 | 第59页 |
| ·P450 BM-3的纯化 | 第59页 |
| ·蛋白质电泳 | 第59-60页 |
| ·P450 BM-3含量的测定 | 第60页 |
| ·酶催化吲哚的动力学参数测定 | 第60-61页 |
| ·DNA序列的测定 | 第61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-79页 |
| ·高通量筛选方法的选择和优化 | 第61-64页 |
| ·LB活性平板分析条件的确定 | 第61-63页 |
| ·96微孔板高通量筛选的选择和优化 | 第63-64页 |
| ·定点突变结果与分析 | 第64-67页 |
| ·P450 BM-3的体外定向进化实验设计 | 第67-68页 |
| ·易错PCR反应体系的优化 | 第68-71页 |
| ·突变文库的大量构建 | 第71-72页 |
| ·高通量筛选结果与讨论 | 第72-73页 |
| ·高活力突变酶基因的测序 | 第73-77页 |
| ·亲本型和突变型P450 BM-3的提取和纯化 | 第77页 |
| ·亲本型和突变型P450 BM-3催化吲哚的动力学分析 | 第77-79页 |
| ·本章小结 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-83页 |
| 第三章 饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3 | 第83-98页 |
| ·引言 | 第83页 |
| ·材料与方法 | 第83-87页 |
| ·试剂与材料 | 第83页 |
| ·培养基 | 第83页 |
| ·实验仪器 | 第83-84页 |
| ·实验方法 | 第84-87页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第84页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第84页 |
| ·饱和突变引物的设计和PCR反应条件 | 第84-86页 |
| ·饱和突变文库的构建和筛选 | 第86页 |
| ·P450 BM-3突变酶的表达 | 第86页 |
| ·P450 BM-3突变酶粗酶液制取 | 第86页 |
| ·P450 BM-3含量的测定 | 第86-87页 |
| ·P450 BM-3突变酶催化吲哚分析 | 第87页 |
| ·结果与讨论 | 第87-96页 |
| ·饱和定点突变技术PCR扩增结果 | 第87-88页 |
| ·各个位点饱和突变文库的构建 | 第88-90页 |
| ·饱和突变文库筛选和DNA测序 | 第90-91页 |
| ·关键氨基酸残基的鉴定 | 第91-96页 |
| ·168位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较 | 第92页 |
| ·225位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较 | 第92-93页 |
| ·434位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较 | 第93-94页 |
| ·435位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较 | 第94-96页 |
| ·本章小结 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-98页 |
| 第四章 单一突变的细胞色素P450 BM-3突变酶基本酶学性质研究 | 第98-112页 |
| ·引言 | 第98页 |
| ·材料与方法 | 第98-100页 |
| ·材料 | 第98页 |
| ·实验仪器 | 第98页 |
| ·实验方法 | 第98-100页 |
| ·P450 BM-3突变酶的表达和纯化 | 第98页 |
| ·突变酶和亲本酶光谱分析 | 第98-99页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第99页 |
| ·P450 BM-3突变酶含量的测定 | 第99页 |
| ·突变酶催化吲哚的羟基化动力学参数测定 | 第99页 |
| ·突变酶电子耦合率的测定 | 第99页 |
| ·突变酶区域专一性的测定 | 第99-100页 |
| ·pH对突变酶羟基化吲哚的影响 | 第100页 |
| ·亲本酶和突变酶的热稳定性的测定 | 第100页 |
| ·结果与讨论 | 第100-109页 |
| ·突变酶表达和纯化 | 第101-102页 |
| ·突变酶吸收光谱分析 | 第102-103页 |
| ·突变酶动力学特征分析 | 第103-105页 |
| ·突变酶电子耦合效率的分析 | 第105-106页 |
| ·突变酶催化吲哚区域选择性的分析 | 第106-107页 |
| ·pH对突变酶羟基化吲哚生成靛蓝的影响 | 第107-108页 |
| ·亲本酶和突变酶的热稳定性 | 第108-109页 |
| ·本章小结 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-112页 |
| 第五章 P450 BM-3突变酶3D结构模建分析 | 第112-125页 |
| ·引言 | 第112页 |
| ·材料与方法 | 第112-113页 |
| ·P450 BM-3与动物同工酶的基因序列比较 | 第112页 |
| ·P450 BM-3突变酶的三维结构模建 | 第112-113页 |
| ·结果与讨论 | 第113-121页 |
| ·同源序列比较分析 | 第113-115页 |
| ·突变位点分析 | 第115-121页 |
| ·突变酶D168H的突变位点分析 | 第116-118页 |
| ·突变酶E435T的突变位点分析 | 第118-120页 |
| ·突变酶K434R和K434G的分析 | 第120-121页 |
| ·本章小结 | 第121-123页 |
| 参考文献 | 第123-125页 |
| 第六章 P450 BM-3突变酶催化苯乙烯的初步研究 | 第125-136页 |
| ·引言 | 第125-127页 |
| ·菌株和质粒 | 第125页 |
| ·试剂 | 第125-126页 |
| ·实验仪器 | 第126页 |
| ·实验方法 | 第126-127页 |
| ·P450 BM-3的表达和纯化 | 第126页 |
| ·P450 BM-3含量的测定 | 第126页 |
| ·P450 BM-3催化苯乙烯反应特性的考察 | 第126页 |
| ·分析与检测 | 第126-127页 |
| ·结果和讨论 | 第127-133页 |
| ·产物的分析和鉴定 | 第127-128页 |
| ·突变酶催化苯乙烯活力的比较 | 第128-129页 |
| ·底物浓度对P450 BM-3催化苯乙烯的影响 | 第129-130页 |
| ·反应进程分析 | 第130-131页 |
| ·pH值对P450 BM-3催化苯乙烯的影响 | 第131页 |
| ·温度对P450 BM-3催化苯乙烯的影响 | 第131-132页 |
| ·助溶剂DMSO对P450 BM-3催化苯乙烯的影响 | 第132-133页 |
| ·本章小结 | 第133-135页 |
| 参考文献 | 第135-136页 |
| 第七章 结论与展望 | 第136-141页 |
| ·结论 | 第136-139页 |
| ·展望 | 第139-141页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第141-142页 |
| 致谢 | 第142-143页 |
| 附录1:64种密码子以及它们所编码的氨基酸 | 第143-144页 |
| 附录2:20种标准氨基酸的英文简写和R基团结构 | 第144-145页 |
| 附录3:1Kb DNA ladder | 第145-146页 |
| 中英文对照和缩写表 | 第146-147页 |
