| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-32页 |
| 1 CYP450研究进展 | 第12-19页 |
| ·CYP450系统的分布 | 第12页 |
| ·CYP450系统的命名 | 第12-13页 |
| ·CYP450结构特征 | 第13-15页 |
| ·CYP450酶系的催化机制 | 第15-16页 |
| ·CYP450酶系的主要功能 | 第16-18页 |
| ·CYP450酶系与药物代谢 | 第18-19页 |
| 2 CYP450 3A4及其单核苷酸多态性的研究进展 | 第19-28页 |
| ·CYP 3A4基因多态性及其突变频率分布 | 第19-24页 |
| ·CYP 3A4基因的结构与定位 | 第19-21页 |
| ·CYP 3A4的基因突变 | 第21-23页 |
| ·CYP 3A4的表型 | 第23-24页 |
| ·CYP 3A4活性的影响因素 | 第24-26页 |
| ·诱导因素和抑制因素 | 第24-25页 |
| ·遗传因素 | 第25页 |
| ·其他因素 | 第25-26页 |
| ·CYP 3A4与药物相互作用 | 第26-28页 |
| ·CYP 3A4的底物及相互作用 | 第26-27页 |
| ·CYP 3A4的抑制剂与药物相互作用 | 第27-28页 |
| 3 药物代谢体外研究模型的发展 | 第28-29页 |
| ·肝脏切片 | 第28页 |
| ·肝细胞 | 第28页 |
| ·人肝脏微粒体 | 第28页 |
| ·CYP450s异源表达系统 | 第28-29页 |
| ·瞬时表达系统 | 第28-29页 |
| ·稳定表达系统 | 第29页 |
| ·转基因动物 | 第29页 |
| 4 CYP 3A4药物检测系统的发展 | 第29-30页 |
| 5 立题背景及意义 | 第30-32页 |
| 实验部分 | 第32-84页 |
| 一 重组CYP3A4酶及其7个突变株的表达和纯化 | 第32-60页 |
| 1 材料 | 第32-37页 |
| ·载体和菌株 | 第32页 |
| ·主要试剂 | 第32页 |
| ·主要溶液 | 第32-34页 |
| ·培养基 | 第34-36页 |
| ·主要实验仪器 | 第36-37页 |
| 2 实验方法 | 第37-45页 |
| ·人肝脏细胞色素P450 3A4原生株重组质粒的构建 | 第37-39页 |
| ·CYP3A4野生型cDNA模板的获取 | 第37页 |
| ·载体pYES2/CT的制备 | 第37-38页 |
| ·CYP3A4_PT cDNA双酶切 | 第38页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第38页 |
| ·TOP10感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| ·重组表达载体转化TOP10感受态细胞 | 第39页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第39页 |
| ·人肝脏细胞色素P450 3A4 7个突变株重组质粒的构建 | 第39-41页 |
| ·特异性引物的设计 | 第39-40页 |
| ·CYP3A4 7个突变株cDNA的扩增 | 第40-41页 |
| ·CYP3A4 7个突变株重组菌株的构建 | 第41页 |
| ·CYP3A4_PT及7个突变株在酵母中的表达 | 第41-43页 |
| ·CYP3A4_PT及7个突变株重组酵母菌株的构建 | 第41页 |
| ·CYP3A4_PT及7个突变株膜蛋白的小量表达 | 第41-42页 |
| ·CYP3A4_PT及7个突变株膜蛋白的大量表达 | 第42-43页 |
| ·CPR重组酶在yCY3中的表达(yCY3-CPR)及活性检测 | 第43-44页 |
| ·CPR重组酶在yCY3中的表达(yCY3-CPR) | 第43页 |
| ·yCY3-CPR的活性检测 | 第43-44页 |
| ·CYP3A4_PT及7个突变株膜蛋白的酶催化活性检测 | 第44-45页 |
| ·yCY107表达的CYP3A4_PT及7个突变株膜蛋白的酶催化活性检测 | 第44页 |
| ·yCY3表达的CYP3A4_PT膜蛋白的酶催化活性检测 | 第44页 |
| ·温度对CYP3A4重组酶催化活性的影响 | 第44页 |
| ·反复冻融对CYP3A4重组酶催化活性的影响 | 第44-45页 |
| ·yCY3-CPR对CYP3A4重组酶催化活性的影响 | 第45页 |
| 3 实验结果与分析 | 第45-57页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第45-47页 |
| ·获得CYP3A4野生型cDNA | 第45-46页 |
| ·获得CYP3A4 7个SNPs的cDNA | 第46页 |
| ·成功构建CYP3A4_PT及7个SNPs的重组子 | 第46-47页 |
| ·CYP3A4_PT及7个SNPs膜蛋白的表达 | 第47-53页 |
| ·yCY107表达的CYP3A4膜蛋白的Western blot分析 | 第47-48页 |
| ·yCY3-CPR和yCY3-CYP3A4_PT的Western blot分析 | 第48页 |
| ·大量表达膜蛋白条件的确定 | 第48-50页 |
| ·微粒体蛋白浓度的测定 | 第50-51页 |
| ·P450含量的测定 | 第51-53页 |
| ·yCY3-CPR的活性测定 | 第53页 |
| ·yCY107-CYP3A4_PT及7个SNPs酶催化活性的测定 | 第53页 |
| ·yCY3-CYP3A4_PT酶催化活性的测定 | 第53-54页 |
| ·温度对CYP3A4酶催化活性的影响 | 第54-55页 |
| ·反复冻融对CYP3A4酶催化活性的影响 | 第55-56页 |
| ·yCY3-CPR对CYP3A4酶催化活性的影响 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-60页 |
| ·表达系统的选择 | 第57-58页 |
| ·表达产物的分析 | 第58-60页 |
| 二 重组酶的酶学分析和药物高通量抑制实验 | 第60-84页 |
| 1 材料 | 第60-62页 |
| ·主要试剂 | 第60页 |
| ·主要溶液 | 第60-61页 |
| ·主要实验仪器 | 第61页 |
| ·抑制实验所选的药物 | 第61-62页 |
| 2 实验方法 | 第62-67页 |
| ·基于荧光检测方法的酶学分析 | 第62-63页 |
| ·酶促反应条件的优化 | 第62页 |
| ·标准曲线的制作 | 第62-63页 |
| ·重组酶的酶促动力学检测 | 第63页 |
| ·数据分析 | 第63页 |
| ·基于液相色谱检测方法的酶学分析 | 第63-65页 |
| ·液相色谱条件的确定 | 第63-64页 |
| ·酶促反应条件的优化 | 第64页 |
| ·样品处理方法的优化 | 第64-65页 |
| ·标准曲线的制作 | 第65页 |
| ·重组酶的酶促动力学检测 | 第65页 |
| ·数据分析 | 第65页 |
| ·药物抑制实验 | 第65-67页 |
| ·抑制实验的过程 | 第66-67页 |
| ·半数抑制常数IC_(50)的计算及分析 | 第67页 |
| ·抑制类型的初步判断 | 第67页 |
| 3 实验结果与分析 | 第67-79页 |
| ·荧光检测方法的建立 | 第67-72页 |
| ·酶促反应条件的确定 | 第67-69页 |
| ·标准曲线的制作 | 第69页 |
| ·重组酶酶促动力学参数的测定 | 第69-72页 |
| ·液相色谱检测方法的建立 | 第72-75页 |
| ·液相色谱条件的确定 | 第72页 |
| ·酶促反应条件的确定 | 第72-73页 |
| ·样品处理方法的确定 | 第73页 |
| ·标准曲线的制作 | 第73-74页 |
| ·重组酶酶促动力学参数的测定 | 第74-75页 |
| ·药物抑制实验 | 第75-79页 |
| ·待测药物IC_(50)值的测定 | 第75-77页 |
| ·药物抑制类型的初步判定 | 第77-79页 |
| 4 讨论 | 第79-84页 |
| ·检测系统的选择 | 第79-80页 |
| ·酶学分析 | 第80-81页 |
| ·药物抑制性分析 | 第81-84页 |
| 全文总结 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-96页 |
| 硕士期间已发表论文 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97页 |
