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重组大肠杆菌几丁质酶的诱导表达、酶学性质及其应用研究

摘要第4-6页
Abstract第6-7页
第1章 引言第12-26页
    1.1 几丁质、水溶性壳聚糖及几丁寡糖第12-15页
        1.1.1 几丁质第12-14页
        1.1.2 水溶性壳聚糖第14-15页
        1.1.3 几丁寡糖第15页
    1.2 几丁质酶的研究现状第15-19页
        1.2.1 产几丁质酶的微生物种类第15-16页
        1.2.2 微生物中几丁质酶的类型第16-18页
        1.2.3 几丁质酶降解几丁质的途径第18页
        1.2.4 几丁质酶的理化性质第18-19页
    1.3 几丁质酶的结构与催化机理第19-22页
        1.3.1 分子结构第19-20页
        1.3.2 催化机理第20-22页
    1.4 N-乙酰氨基葡萄糖的测定方法第22-23页
    1.5 应用第23-24页
        1.5.1 几丁质及其衍生物的应用第23页
        1.5.2 几丁质酶的应用第23-24页
        1.5.3 几丁寡糖的应用第24页
    1.6 本研究的意义、目的及内容第24-26页
第2章 pETM-LlChi18A在E.coli中的诱导表达第26-37页
    2.1 前言第26页
    2.2 实验材料第26-28页
        2.2.1 质粒与宿主菌第26-27页
        2.2.2 主要试剂第27页
        2.2.3 主要仪器第27-28页
        2.2.4 培养基和常用试剂的配制第28页
    2.3 实验方法第28-30页
        2.3.1 E.coliBL21(DE3)感受态的制备第28-29页
        2.3.2 重组质粒pETM-LlChi18A的转化第29页
        2.3.3 PCR检测E.coli中的重组质粒第29页
        2.3.4 重组质粒pETM-LlChi18A的诱导表达第29页
        2.3.5 重组蛋白的可溶性分析第29页
        2.3.6 蛋白的SDS-PAGE检测第29-30页
        2.3.7 pETM-LlChi18A诱导表达条件的优化第30页
    2.4 结果与讨论第30-36页
        2.4.1 pETM-LlChi18A的转导第30-31页
        2.4.2 PCR检测结果第31-32页
        2.4.3 IPTG诱导表达及SDS-PAGE分析第32页
        2.4.4 重组蛋白的可溶性分析第32-33页
        2.4.5 温度对IPTG诱导表达的影响第33-34页
        2.4.6 诱导时间对IPTG诱导表达的影响第34-35页
        2.4.7 IPTG诱导量对IPTG诱导表达的影响第35-36页
    2.5 本章小结第36-37页
第3章 几丁质酶LlChi18A纯化及包涵体复性第37-53页
    3.1 前言第37页
    3.2 实验材料第37-39页
        3.2.1 菌株第37页
        3.2.2 主要试剂第37-38页
        3.2.3 主要仪器第38页
        3.2.4 常用试剂的配制第38-39页
    3.3 实验方法第39-42页
        3.3.1 几丁质酶LlChi18A重组蛋白纯化第39页
        3.3.2 蛋白质浓度的测定第39页
        3.3.3 SDS-PAGE分析第39-40页
        3.3.4 荧光法测酶活第40页
        3.3.5 几丁质酶LlChi18A包涵体复性第40-41页
        3.3.6 复性条件对包涵体复性的影响第41页
        3.3.7 pH和温度对酶活的影响第41页
        3.3.8 金属离子对酶活的影响第41-42页
        3.3.9 反应时间对酶活的影响第42页
    3.4 结果与分析第42-51页
        3.4.1 重组几丁质酶LlChi18A的纯化第42-43页
        3.4.2 蛋白质标准曲线及目的蛋白浓度第43-44页
        3.4.3 荧光测定4-MU标准曲线及酶活第44页
        3.4.4 透析复性与亲和层析柱上复性的比较第44-46页
        3.4.5 亲和层析柱上复性影响酶活的因素第46-48页
        3.4.6 pH及温度、反应时间对重组蛋白酶活的影响第48-50页
        3.4.7 金属离子对酶活的影响第50-51页
    3.5 本章小结第51-53页
第4章 几丁质酶催化不同底物的反应条件及产物研究第53-66页
    4.1 前言第53页
    4.2 实验材料第53-55页
        4.2.1 菌株第53-54页
        4.2.2 主要试剂第54页
        4.2.3 主要仪器第54-55页
        4.2.4 常用试剂的配制第55页
    4.3 实验方法第55-57页
        4.3.1 不同底物的制备第55页
        4.3.2 酶的底物特异性第55-56页
        4.3.3 动力学方程第56页
        4.3.4 几丁质酶对不同底物的酶学性质第56-57页
        4.3.5 几丁质酶降解产物的分析第57页
    4.4 结果与分析第57-64页
        4.4.1 还原糖标准曲线的绘制第57-58页
        4.4.2 几丁质酶的底物特异性第58-59页
        4.4.3 动力学方程第59-60页
        4.4.4 反应pH值对酶活的影响第60页
        4.4.5 反应温度对酶活的影响第60-61页
        4.4.6 金属离子对酶活的影响第61-62页
        4.4.7 表面活性剂对酶活的影响第62-63页
        4.4.8 几丁质酶降解产物的分析第63-64页
    4.5 本章小结第64-66页
第5章 酶法降解降解废菌丝体制备几丁寡糖的研究第66-80页
    5.1 前言第66页
    5.2 实验材料第66-68页
        5.2.1 原材料第66-67页
        5.2.2 主要试剂第67页
        5.2.3 主要仪器第67-68页
        5.2.4 常用试剂的配制第68页
        5.2.5 检测方法第68页
    5.3 实验方法第68-70页
        5.3.1 废菌丝体预处理第68页
        5.3.2 浸泡废菌丝体第68-69页
        5.3.3 酶解废菌丝体破壁第69页
        5.3.4 几丁质酶降解废菌丝体第69页
        5.3.5 几丁质酶降解条件的优化第69-70页
        5.3.6 废菌丝体降解产物的HPLC/MS检测第70页
        5.3.7 几丁寡糖的产率第70页
    5.4 结果与分析第70-79页
        5.4.1 最适浸泡废菌丝体的试剂和时间第70-71页
        5.4.2 最适酶解废菌丝体的酶和酶解时间第71-72页
        5.4.3 几丁质酶降解条件的优化第72-76页
        5.4.4 降解产物的HPLC/MS检测第76-77页
        5.4.5 几丁寡糖产率第77-79页
    5.5 本章小结第79-80页
第6章 展望与总结第80-83页
    6.1 总结第80-81页
    6.2 创新点第81页
    6.3 展望第81-83页
参考文献第83-89页
致谢第89-90页
附录第90页

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