| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写符号术语表 | 第9-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-35页 |
| 1.1 腈水合酶概述 | 第15-22页 |
| 1.1.1 腈水合酶的来源 | 第15-17页 |
| 1.1.2 腈水合酶的种类 | 第17-18页 |
| 1.1.3 腈水合酶的结构特征 | 第18-19页 |
| 1.1.4 腈水合酶的催化机理 | 第19-20页 |
| 1.1.5 腈水合酶的性质 | 第20-22页 |
| 1.2 常见酶的表达体系和表达优化 | 第22-28页 |
| 1.2.1 酶的表达体系 | 第22-24页 |
| 1.2.1.1 大肠杆菌 | 第22-23页 |
| 1.2.1.2 枯草芽孢杆菌 | 第23页 |
| 1.2.1.3 谷氨酸棒杆菌 | 第23-24页 |
| 1.2.1.4 酵母 | 第24页 |
| 1.2.2 表达优化 | 第24-28页 |
| 1.2.2.1 复制子 | 第24-25页 |
| 1.2.2.2 启动子 | 第25-26页 |
| 1.2.2.3 密码子 | 第26页 |
| 1.2.2.4 翻译起始区域 | 第26-27页 |
| 1.2.2.5 融合标签 | 第27页 |
| 1.2.2.6 高密度发酵 | 第27-28页 |
| 1.3 腈水合酶的重组表达现状 | 第28-30页 |
| 1.3.1 腈水合酶在大肠杆菌中的表达 | 第28-30页 |
| 1.3.2 腈水合酶在其他宿主中的表达 | 第30页 |
| 1.4 腈水合酶的工业应用 | 第30-33页 |
| 1.4.1 医药化工行业 | 第30-31页 |
| 1.4.2 精细化工行业 | 第31-32页 |
| 1.4.3 食品饲料添加剂行业 | 第32页 |
| 1.4.4 环境修复 | 第32-33页 |
| 1.5 论文的研究目标 | 第33页 |
| 1.6 论文的研究思路和内容 | 第33-35页 |
| 第二章 大肠杆菌中腈水合酶的增强表达 | 第35-56页 |
| 2.1 引言 | 第35页 |
| 2.2 材料与方法 | 第35-46页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第35页 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.3 培养基与试剂配制 | 第36-37页 |
| 2.2.4 菌种和质粒 | 第37页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制作 | 第37-38页 |
| 2.2.6 转化与验证 | 第38页 |
| 2.2.7 DNA操作 | 第38-39页 |
| 2.2.7.1 质粒提取 | 第38页 |
| 2.2.7.2 普通PCR | 第38-39页 |
| 2.2.7.3 重叠延伸PCR | 第39页 |
| 2.2.7.4 全质粒PCR定点突变 | 第39页 |
| 2.2.7.5 DNA凝胶回收 | 第39页 |
| 2.2.7.6 快速克隆 | 第39页 |
| 2.2.8 表达载体构建 | 第39-43页 |
| 2.2.8.1 载体pCDFDuet-acc的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.8.2 载体pCDFDuet-acc(SK)的构建 | 第41页 |
| 2.2.8.3 载体pCDFDuet-acc(SKI)的构建 | 第41页 |
| 2.2.8.4 载体pCDFDuet-acc(SKIK)的构建 | 第41页 |
| 2.2.8.5 载体pET28-α-β-acc(SKI)的构建 | 第41页 |
| 2.2.8.6 载体pET28-α-β-acc(SKIK)的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.8.7 载体pCDFDuet-β的构建 | 第42页 |
| 2.2.8.8 载体pCDFDuet-β(SKI)的构建 | 第42页 |
| 2.2.8.9 载体pCDFDuet-β(SKIK)的构建 | 第42页 |
| 2.2.8.10 载体pET28-α-β(SKI)-acc(SKIK)的构建 | 第42页 |
| 2.2.8.11 载体pET28-α-β(SKIK)-acc(SKIK)的构建 | 第42-43页 |
| 2.2.8.12 载体pET28-α(mut)-β-acc(SKIK)的构建 | 第43页 |
| 2.2.9 mRNA结构分析 | 第43页 |
| 2.2.10 重组腈水合酶的诱导和表达 | 第43页 |
| 2.2.11 菌体收集和细胞破碎 | 第43-44页 |
| 2.2.12 SDS-PAGE电泳 | 第44页 |
| 2.2.13 蛋白质纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.14 腈水合酶酶活测定 | 第45-46页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第46-55页 |
| 2.3.1 激活蛋白的增强表达 | 第46-50页 |
| 2.3.1.1 激活蛋白单质粒表达 | 第46-48页 |
| 2.3.1.2 双质粒共表达策略 | 第48页 |
| 2.3.1.3 多顺反子策略 | 第48-50页 |
| 2.3.2 β亚基的增强表达 | 第50-54页 |
| 2.3.2.1 β亚基单独增强表达 | 第50-51页 |
| 2.3.2.2 多顺反子策略 | 第51-52页 |
| 2.3.2.3 同义突变策略 | 第52-54页 |
| 2.3.3 重组腈水合酶的纯化与比酶活测定 | 第54-55页 |
| 2.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第三章 谷氨酸棒杆菌异源表达腈水合酶系统构建 | 第56-71页 |
| 3.1 引言 | 第56页 |
| 3.2 材料与方法 | 第56-63页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第56页 |
| 3.2.2 实验药品与试剂 | 第56-57页 |
| 3.2.3 培养基配制 | 第57页 |
| 3.2.4 质粒与菌种 | 第57页 |
| 3.2.5 感受态细胞制作 | 第57-58页 |
| 3.2.6 转化与验证 | 第58页 |
| 3.2.7 DNA操作 | 第58页 |
| 3.2.8 表达载体的构建 | 第58-62页 |
| 3.2.8.1 载体pXMJ 19-P43-NH08的构建 | 第59-60页 |
| 3.2.8.2 载体pXMJ 19-PilvC-NH08的构建 | 第60页 |
| 3.2.8.3 载体pEC-XK99E-NH08的构建 | 第60页 |
| 3.2.8.4 载体pEKEX2-NH08的构建 | 第60页 |
| 3.2.8.5 载体pEKEX2-NHopt的构建 | 第60-61页 |
| 3.2.8.6 载体pEKEX2-SD50000-NHopt的构建 | 第61页 |
| 3.2.8.7 载体pEKEX2-SD 100000-NHopt的构建 | 第61页 |
| 3.2.8.8 载体pEKEX2-mmp-SD50000-NHopt的构建 | 第61页 |
| 3.2.8.9 载体pEKEX2-de3-SD50000-NHopt的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.9 密码子优化 | 第62页 |
| 3.2.10 SD序列设计 | 第62页 |
| 3.2.11 重组腈水合酶的诱导和表达 | 第62页 |
| 3.2.12 菌体收集和细胞破碎 | 第62-63页 |
| 3.2.13 SDS-PAGE | 第63页 |
| 3.2.14 腈水合酶酶活测定 | 第63页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第63-70页 |
| 3.3.1 腈水合酶的组成型表达 | 第63-64页 |
| 3.3.2 腈水合酶的诱导型表达 | 第64-65页 |
| 3.3.3 密码子优化 | 第65-67页 |
| 3.3.4 SD序列的设计 | 第67-68页 |
| 3.3.5 新型表达系统的引入 | 第68-70页 |
| 3.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第四章 重组大肠杆菌发酵 | 第71-84页 |
| 4.1 引言 | 第71页 |
| 4.2 材料与方法 | 第71-73页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第71页 |
| 4.2.2 实验药品与试剂 | 第71-72页 |
| 4.2.3 菌株 | 第72页 |
| 4.2.4 培养基 | 第72页 |
| 4.2.5 培养方法 | 第72页 |
| 4.2.6 摇瓶优化 | 第72-73页 |
| 4.2.7 分析方法 | 第73页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第73-83页 |
| 4.3.1 培养基优化 | 第73-78页 |
| 4.3.1.1 不同氮源比较 | 第73-74页 |
| 4.3.1.2 复合氮源优化 | 第74-75页 |
| 4.3.1.3 复合氮源比例优化 | 第75页 |
| 4.3.1.4 复合氮源浓度优化 | 第75-76页 |
| 4.3.1.5 不同碳源比较 | 第76-77页 |
| 4.3.1.6 碳源浓度比较 | 第77-78页 |
| 4.3.2 诱导条件优化 | 第78-81页 |
| 4.3.2.1 不同诱导剂比较 | 第78-79页 |
| 4.3.2.2 诱导剂浓度优化 | 第79页 |
| 4.3.2.3 钴离子浓度优化 | 第79-80页 |
| 4.3.2.4 诱导温度优化 | 第80-81页 |
| 4.3.3 重组大肠杆菌的发酵实验 | 第81-83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-84页 |
| 第五章 重组谷氨酸棒杆菌发酵 | 第84-94页 |
| 5.1 引言 | 第84页 |
| 5.2 材料与方法 | 第84-86页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第84页 |
| 5.2.2 实验药品与试剂 | 第84页 |
| 5.2.3 发酵菌种 | 第84-85页 |
| 5.2.4 培养基 | 第85页 |
| 5.2.5 培养方法 | 第85页 |
| 5.2.6 摇瓶优化 | 第85页 |
| 5.2.7 分析方法 | 第85-86页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第86-93页 |
| 5.3.1 培养基优化 | 第86-89页 |
| 5.3.1.1 不同氮源比较 | 第86-87页 |
| 5.3.1.2 氮源浓度优化 | 第87页 |
| 5.3.1.3 不同碳源比较 | 第87-88页 |
| 5.3.1.4 生长因子优化 | 第88-89页 |
| 5.3.2 诱导条件优化 | 第89-91页 |
| 5.3.2.1 IPTG浓度 | 第89-90页 |
| 5.3.2.2 钴离子浓度 | 第90-91页 |
| 5.3.2.3 诱导温度 | 第91页 |
| 5.3.3 重组谷氨酸棒杆菌的发酵实验 | 第91-93页 |
| 5.4 本章小结 | 第93-94页 |
| 第六章 重组腈水合酶催化制备酰胺初探 | 第94-110页 |
| 6.1 引言 | 第94页 |
| 6.2 材料与方法 | 第94-100页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第94页 |
| 6.2.2 实验药品与试剂 | 第94-95页 |
| 6.2.3 菌株 | 第95页 |
| 6.2.4 培养基及培养方法 | 第95页 |
| 6.2.5 静息细胞的制备 | 第95页 |
| 6.2.6 全细胞催化制备酰胺 | 第95-100页 |
| 6.2.6.1 重组大肠杆菌分批补料催化制备烟酰胺 | 第95页 |
| 6.2.6.2 重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化制备烟酰胺 | 第95-96页 |
| 6.2.6.3 重组大肠杆菌催化制备2,6-二氟苯甲酰胺 | 第96-100页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第100-109页 |
| 6.3.1 重组大肠杆菌制备烟酰胺 | 第100-101页 |
| 6.3.2 重组谷氨酸棒杆菌制备烟酰胺 | 第101-104页 |
| 6.3.2.1 温度和温度稳定性 | 第101-102页 |
| 6.3.2.2 最适pH | 第102页 |
| 6.3.2.3 不同底物浓度对反应的影响 | 第102-103页 |
| 6.3.2.4 分批补料制备烟酰胺 | 第103-104页 |
| 6.3.3 重组大肠杆菌制备2,6-二氟苯甲酰胺工艺研究 | 第104-109页 |
| 6.3.3.1 最适温度和温度稳定性 | 第104-105页 |
| 6.3.3.2 最适pH和无缓冲液催化体系 | 第105-106页 |
| 6.3.3.3 助溶剂的筛选 | 第106页 |
| 6.3.3.4 不同底物投料方式比较 | 第106-107页 |
| 6.3.3.5 底物添加量对反应影响 | 第107-108页 |
| 6.3.3.6 50 L反应体系 | 第108-109页 |
| 6.4 本章小结 | 第109-110页 |
| 第七章 结论与展望 | 第110-114页 |
| 7.1 结论 | 第110-112页 |
| 7.2 本论文的创新点 | 第112-113页 |
| 7.3 展望 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-131页 |
| 附录 | 第131-139页 |
| 在学期间所取得的科研成果 | 第139页 |
