| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-27页 |
| 1 CHO细胞 | 第11-14页 |
| 1.1 CHO细胞系 | 第11-12页 |
| 1.2 CHO细胞表达系统 | 第12-14页 |
| 2 外泌体 | 第14-19页 |
| 2.1 外泌体的发现 | 第14-15页 |
| 2.2 外泌体的特征 | 第15-17页 |
| 2.3 外泌体的分离与鉴别 | 第17-19页 |
| 3 外泌体——天然载药系统 | 第19-25页 |
| 3.1 外泌体作为载药系统的优势 | 第19-20页 |
| 3.2 外泌体载药 | 第20-22页 |
| 3.2.1 小分子类药物 | 第20-21页 |
| 3.2.2 基因类药物 | 第21页 |
| 3.2.3 蛋白类药物 | 第21-22页 |
| 3.3 外泌体的应用 | 第22-25页 |
| 3.3.1 外泌体应用于疾病诊断 | 第22-24页 |
| 3.3.2 外泌体应用于药物载体 | 第24-25页 |
| 4 本论文的研究目的和意义 | 第25-26页 |
| 5 技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 稳定表达抗体的CHO细胞外泌体的蛋白质组成分析 | 第27-54页 |
| 1 实验材料 | 第27-34页 |
| 1.1 主要仪器 | 第27-28页 |
| 1.2 实验耗材 | 第28页 |
| 1.3 细胞株 | 第28页 |
| 1.4 主要试剂与试剂盒 | 第28-29页 |
| 1.5 使用试剂及配制 | 第29-34页 |
| 2 实验方法 | 第34-41页 |
| 2.1 细胞密度与活率 | 第34-35页 |
| 2.2 蛋白印迹 | 第35页 |
| 2.3 SEC-HPLC测定抗体表达量 | 第35-36页 |
| 2.4 抗体的ProteinA一步纯化 | 第36-37页 |
| 2.5 外泌体的提取 | 第37-38页 |
| 2.6 NTA测定外泌体的粒径与浓度 | 第38-39页 |
| 2.7 透射电镜获取外泌体的形态 | 第39页 |
| 2.8 外泌体中蛋白质的提取及酶解 | 第39-40页 |
| 2.9 数据分析 | 第40页 |
| 2.10 抗体的活性测定 | 第40-41页 |
| 2.10.1 Her2抗体活性的检测 | 第40-41页 |
| 2.10.2 TNFR-Fc活性的检测 | 第41页 |
| 3 实验结果与分析 | 第41-52页 |
| 3.1 稳定表达Her2抗体的CHO细胞外泌体分析 | 第41-47页 |
| 3.1.1 稳定表达Her2抗体CHO细胞的培养与表达纯化 | 第41-43页 |
| 3.1.2 外泌体的表征 | 第43-44页 |
| 3.1.3 外泌体中Her2抗体鉴定及活性检测 | 第44-45页 |
| 3.1.4 外泌体中蛋白质表达谱分析 | 第45-47页 |
| 3.2 稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞外泌体分析 | 第47-52页 |
| 3.2.1 稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞的培养与表达纯化 | 第47-48页 |
| 3.2.2 外泌体的表征 | 第48-49页 |
| 3.2.3 外泌体中TNFR-Fc鉴定及活性检测 | 第49页 |
| 3.2.4 外泌体中蛋白质表达谱分析 | 第49-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 影响外泌体装载外源蛋白的探讨 | 第54-74页 |
| 1 实验材料 | 第54-57页 |
| 1.1 主要仪器 | 第54页 |
| 1.2 实验耗材 | 第54-55页 |
| 1.3 试剂配制 | 第55-57页 |
| 2 实验方法 | 第57-64页 |
| 2.1 细菌培养与质粒抽提 | 第57-58页 |
| 2.1.1 细菌培养 | 第57页 |
| 2.1.2 质粒抽提 | 第57-58页 |
| 2.2 感受态的制备 | 第58页 |
| 2.3 含有信号肽的重组蛋白质粒的构建 | 第58-63页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第58-59页 |
| 2.3.2 PCR | 第59-63页 |
| 2.3.2.1 反应体系 | 第59页 |
| 2.3.2.2 反应条件 | 第59-60页 |
| 2.3.2.3 PCR产物凝胶检测 | 第60页 |
| 2.3.2.4 PCR产物纯化 | 第60页 |
| 2.3.2.5 酶切反应 | 第60-61页 |
| 2.3.2.6 酶切产物切胶回收 | 第61-62页 |
| 2.3.2.7 酶连反应 | 第62页 |
| 2.3.2.8 转化 | 第62页 |
| 2.3.2.9 菌落PCR | 第62-63页 |
| 2.3.2.10 DNA测序验证 | 第63页 |
| 2.4 质粒瞬时转染技术 | 第63页 |
| 2.5 统计学分析 | 第63-64页 |
| 3 实验结果与分析 | 第64-72页 |
| 3.1 分泌效率对外泌体包装蛋白的影响 | 第64-69页 |
| 3.1.1 EGFP重组质粒的构建与鉴定 | 第64-65页 |
| 3.1.2 重组质粒EGFP在CHO细胞中表达 | 第65-67页 |
| 3.1.3 重组质粒EGFP分泌效率的比较 | 第67-68页 |
| 3.1.4 重组质粒EGFP的外泌体分析 | 第68页 |
| 3.1.5 外泌体中重组EGFP蛋白的装载率比较 | 第68-69页 |
| 3.2 蛋白表达量对外泌体包装蛋白的影响 | 第69-72页 |
| 3.2.1 重组蛋白低表达量的CHO细胞的培养 | 第69-70页 |
| 3.2.2 不同表达量CHO细胞中重组蛋白的检测 | 第70-71页 |
| 3.2.3 不同蛋白表达量细胞外泌体装载效率的比较 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 1 结论 | 第74页 |
| 2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 硕士期间发表论文 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
