| 摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-7页 |
| 中英文缩写 | 第7-11页 |
| 前言 | 第11-12页 |
| 一、文献综述 | 第12-30页 |
| 1. 抗菌肽简述 | 第12-18页 |
| ·抗菌肽的种类、结构及其一般性质 | 第12-14页 |
| ·Cathelicidins家族 | 第13-14页 |
| ·Defensins家族 | 第14页 |
| ·抗菌肽的作用机理 | 第14-16页 |
| ·细胞膜损伤机理 | 第15页 |
| ·胞内损伤机理 | 第15-16页 |
| ·影响抗茵肽活性的因素 | 第16-18页 |
| ·端残基与功能长度对抗菌肽活性的影响 | 第16页 |
| ·带电荷氨基酸对抗菌肽活性的影响 | 第16-17页 |
| ·残基置换对抗菌肽活性的影响 | 第17页 |
| ·氨基酸构象对抗菌肽活性的影响 | 第17-18页 |
| ·应用前景和面临的问题 | 第18页 |
| 2. 乳铁蛋白肽简述 | 第18-24页 |
| ·乳铁蛋白肽结构 | 第20页 |
| ·牛乳铁蛋白肽作用机制及功能 | 第20-23页 |
| ·杀菌、抑菌作用 | 第21-22页 |
| ·抗寄生虫 | 第22页 |
| ·抗病毒 | 第22页 |
| ·抗癌 | 第22-23页 |
| ·调控基因表达 | 第23页 |
| ·乳铁蛋白肽应用前景 | 第23-24页 |
| 3. 大肠杆菌表达系统的简介 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌表达系统发展历史 | 第24页 |
| ·大肠杆菌表达系统的构成 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌表达系统的特征及优越性 | 第25页 |
| 4. 研究目的 | 第25页 |
| 5. 研究内容 | 第25-26页 |
| 6. 选题依据及研究意义 | 第26-28页 |
| ·牛乳铁蛋白肽代替抗生素的意义 | 第26-27页 |
| ·牛乳铁蛋白肽对仔猪腹泻的意义 | 第27-28页 |
| ·牛乳铁蛋白肽可提高饲料的抗氧化能力 | 第28页 |
| 7. 实验创新性及预期结果 | 第28页 |
| 8. 研究的技术路线 | 第28-30页 |
| 二、材料与方法 | 第30-41页 |
| 1. 材料和仪器 | 第30-32页 |
| ·材料 | 第30页 |
| ·试剂 | 第30页 |
| ·酶 | 第30页 |
| ·试剂盒 | 第30页 |
| ·核酸及蛋白分子量标准 | 第30页 |
| ·主要试剂 | 第30页 |
| ·主要培养基 | 第30-31页 |
| ·主要溶液 | 第31页 |
| ·主要仪器设备 | 第31-32页 |
| ·引物设计与合成 | 第32页 |
| 2. 实验方法 | 第32-41页 |
| ·Lfcin B基因的合成 | 第32-33页 |
| ·E. coli/pET-30a(+)-Lfcin B表达载体的构建 | 第33-36页 |
| ·含BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第33页 |
| ·PCR产物和pET-30a(+)质粒的酶切与连接 | 第33-35页 |
| ·感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选 | 第35-36页 |
| ·重组Lfcin B的转化与表达 | 第36-38页 |
| ·提取pET-30a(+)-Lfcin B质粒 | 第36页 |
| ·pET-30a(+)-Lfcin B重组质粒E. coli的转化与转化子的筛选 | 第36-37页 |
| ·重组Lfcin B的IPTG诱导表达 | 第37-38页 |
| ·重组蛋白包涵体的制备、纯化及溶解 | 第38页 |
| ·包涵体的制备 | 第38页 |
| ·包涵体的纯化和洗涤 | 第38页 |
| ·包涵体的溶解 | 第38页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| ·纯化重组蛋白的SDS-PAGE检测 | 第39页 |
| ·重组蛋白的活性检测 | 第39-41页 |
| ·胃蛋白酶消化重组蛋白,释放Lfcin B | 第39页 |
| ·牛津杯法测定重组Lfcin B的抑菌活力 | 第39-41页 |
| 三、实验结果与分析 | 第41-48页 |
| 1. 含牛乳铁蛋白基因片段Top10/pUC19-Lfcin B的合成 | 第41页 |
| 2. pET-30a(+)-Lfcin B重组表达质粒构建及鉴定 | 第41-44页 |
| ·含酶切位点Lfcin B基因片段的扩增结果 | 第41-42页 |
| ·pET-30a(+)质粒的双酶切 | 第42-43页 |
| ·含酶切位点Lfcin B基因片段的双酶切结果 | 第43页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3. E. coli/pET-30a(+)-Lfcin B表达菌株的转化与筛选 | 第44-46页 |
| ·PCR检测转化子 | 第44-45页 |
| ·Lfcin B在E. coli中的表达 | 第45页 |
| ·Lfcin B在E. coli中的表达产物纯化 | 第45-46页 |
| 4. 牛津杯法测定重组Lfcin B的抑菌活力 | 第46-48页 |
| 四、讨论 | 第48-57页 |
| 1. 原核表达宿主菌的选择 | 第48-49页 |
| 2. 关于重组质粒和菌株的保存 | 第49页 |
| 3. 关于大肠杆菌表达外源基因引物的设计 | 第49-50页 |
| 4. 原核表达条件的优化 | 第50-55页 |
| ·关于 mRNA稳定性的讨论 | 第50-51页 |
| ·关于目的蛋白细胞质内表达的讨论 | 第51-52页 |
| ·关于提高表达蛋白的天然空间结构的形成 | 第52页 |
| ·蛋白质的蛋白酶解问题探讨 | 第52-53页 |
| ·选用融合蛋白表达的优势 | 第53-54页 |
| ·培养条件的 | 第54-55页 |
| 5. 目的蛋白的纯化 | 第55页 |
| 6. 关于目的蛋白基因的设计合成 | 第55-57页 |
| 五、结论与展望 | 第57-58页 |
| 1. 研究结论 | 第57页 |
| 2. 展望 | 第57-58页 |
| ·改造Lfcin B的分子结构提高其活性 | 第57页 |
| ·优化Lfcin B工程菌的发酵工艺研究 | 第57页 |
| ·动物饲喂实验 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-65页 |
| 附录一 | 第65-66页 |
| 附录二 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
