| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-7页 |
| 中英文缩写词表 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 一 文献综述 | 第14-32页 |
| 1 a-淀粉酶概述 | 第14-17页 |
| ·a-淀粉酶发现 | 第14页 |
| ·a-淀粉酶来源 | 第14页 |
| ·淀粉酶分类 | 第14-15页 |
| ·a-淀粉酶的主要用途 | 第15-17页 |
| ·饲料行业上的应用 | 第15页 |
| ·酿造发酵业 | 第15页 |
| ·纺织褪浆 | 第15-16页 |
| ·面包和烘焙行业 | 第16页 |
| ·造纸工业 | 第16页 |
| ·洗涤剂应用 | 第16页 |
| ·医药和临床分析 | 第16-17页 |
| ·淀粉加工 | 第17页 |
| 2 a-淀粉酶的结构特点 | 第17-20页 |
| ·a-淀粉酶的氨基酸组成 | 第17-18页 |
| ·a-淀粉酶的空间结构 | 第18-19页 |
| ·猪的胰腺a-淀粉酶的结构 | 第19-20页 |
| 3 a-淀粉酶性质 | 第20-21页 |
| ·pH对酶活性的影响 | 第20页 |
| ·温度对酶活性的影响 | 第20-21页 |
| ·与a-淀粉酶活性的关系的部分离子 | 第21页 |
| ·a-淀粉酶与底物的作用的特性 | 第21页 |
| 4 a-淀粉酶的催化机制 | 第21-22页 |
| 5 a-淀粉酶研究进展 | 第22-24页 |
| ·酸性a-淀粉酶 | 第23页 |
| ·耐碱性a-淀粉酶 | 第23页 |
| ·耐高温a-淀粉酶 | 第23-24页 |
| ·低温a-淀粉酶 | 第24页 |
| 6 a-淀粉酶基因克隆表达研究进展 | 第24-29页 |
| ·a-淀粉酶基因的克隆 | 第24-25页 |
| ·a-淀粉酶基因表达研究进展 | 第25-29页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第25-26页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的应用 | 第26-29页 |
| 7 选题背景和依据 | 第29-32页 |
| ·a-淀粉酶应用面临的问题 | 第29页 |
| ·猪体内的PPA分泌特性 | 第29-31页 |
| ·本实验拟解决的问题 | 第31页 |
| ·预期结果及创新性 | 第31-32页 |
| 二 材料与方法 | 第32-48页 |
| 1 材料和仪器 | 第32-35页 |
| ·材料与试剂 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32-33页 |
| ·主要溶液 | 第33-34页 |
| ·主要仪器设备 | 第34-35页 |
| ·引物设计与合成 | 第35页 |
| 2 实验方法 | 第35-48页 |
| ·PPA基因的克隆 | 第35-39页 |
| ·胰腺组织总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·基因的扩增 | 第36-37页 |
| ·TA克隆和测序 | 第37-39页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-PPA表达载体的构建 | 第39-41页 |
| ·含KnpⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第39页 |
| ·PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接 | 第39-40页 |
| ·感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选 | 第40-41页 |
| ·重组猪PPA的酵母转化与表达 | 第41-45页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-PPA的线性化 | 第41-42页 |
| ·pPICZαA-PPA重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选 | 第42-44页 |
| ·重组PPA的诱导表达 | 第44页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| ·a-淀粉酶酶活测定 | 第45-46页 |
| ·a-淀粉酶酶学性质分析 | 第46-48页 |
| ·pH值对a-淀粉酶酶活的影响 | 第46页 |
| ·温度对a-淀粉酶活的影响 | 第46-47页 |
| ·a-淀粉酶热稳定性 | 第47页 |
| ·a-淀粉酶酶促反应动力学参数米氏常数(Km)测定 | 第47页 |
| ·部分常用离子对a-淀粉酶酶活的影响 | 第47-48页 |
| 三 实验结果与分析 | 第48-58页 |
| ·PPA编码基因TA克隆 | 第48-49页 |
| ·总RNA的提取与PPA编码区RT-PCR扩增 | 第48页 |
| ·PPA基因TA克隆 | 第48-49页 |
| ·PPA编码基因表达载体构建 | 第49-51页 |
| ·含酶切位点PPA基因片段的扩增结果 | 第49页 |
| ·pPICZαA质粒的双酶切 | 第49页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第49-51页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-PPA表达菌株的转化与筛选 | 第51-53页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第51页 |
| ·PCR检测转化子 | 第51-52页 |
| ·Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测 | 第52-53页 |
| ·PPA在P.pastoris中的表达与纯化 | 第53页 |
| ·重组酶a-淀粉酶酶学性质分析 | 第53-58页 |
| ·pH对a-淀粉酶活性的影响 | 第53-54页 |
| ·温度对a-淀粉酶活性的影响 | 第54页 |
| ·重组酶热稳定性 | 第54-55页 |
| ·动力学特性 | 第55页 |
| ·金属离子对重组蛋白酶活的影响 | 第55-58页 |
| 四 讨论 | 第58-63页 |
| 1 载体构建 | 第58-59页 |
| ·限制性内切酶的筛选 | 第58页 |
| ·引物设计 | 第58-59页 |
| ·Taq酶的选择 | 第59页 |
| ·RePPA与天然PPA在结构上的差异 | 第59页 |
| 2 PPA基因在毕赤酵母中的表达 | 第59-61页 |
| ·表达体系的选择 | 第59-61页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第61页 |
| 3 酶学特性分析 | 第61-63页 |
| 五 结论与展望 | 第63-64页 |
| ·PPA提高表达产量的研究 | 第63页 |
| ·改造PPA的分子结构提高其活性范围 | 第63页 |
| ·利用PPA的高表达量来串联融合表达其他蛋白 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 附录 | 第71-73页 |
