| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 符号与缩略语 | 第15-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一篇 文献综述 | 第18-63页 |
| 第一章 弓形虫病研究概况 | 第19-41页 |
| 1 弓形虫病概述 | 第19-20页 |
| 2 与弓形虫入侵及毒力相关的虫体蛋白 | 第20-21页 |
| 3 弓形虫病致病机理研究进展 | 第21-28页 |
| 4 弓形虫病的诊断研究进展 | 第28-29页 |
| 参考文献 | 第29-41页 |
| 第二章 血清蛋白质组学研究进展及其在寄生虫研究方面的应用 | 第41-51页 |
| 1 蛋白质组学的概念和研究内容 | 第41-42页 |
| 2 蛋白质组学研究方法 | 第42-44页 |
| 3 血清水平的蛋白质组学研究 | 第44-45页 |
| 4 蛋白质组学在寄生虫研究上的应用 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 第三章 CRISPR/CAS9基因敲除技术研究进展 | 第51-63页 |
| 1 CRISPR发展过程 | 第51-52页 |
| 2 CRISPR的结构 | 第52-53页 |
| 3 CRISPR作用机理 | 第53-54页 |
| 4 CRISPR/CAS9基因敲除原理 | 第54-56页 |
| 5 CRISPR技术的应用前景 | 第56页 |
| 参考文献 | 第56-63页 |
| 第二篇 试验研究 | 第63-155页 |
| 第四章 利用免疫蛋白组学鉴定弓形虫急性感染血清中的循环抗原 | 第65-91页 |
| 1 材料与方法 | 第66-71页 |
| 1.1 细胞、弓形虫及实验动物 | 第66-67页 |
| 1.2 试剂材料 | 第67页 |
| 1.3 仪器 | 第67页 |
| 1.4 ESA及其多克隆抗体的制备 | 第67页 |
| 1.5 不同感染天数的急性感染弓形虫犬血清样本的制备 | 第67页 |
| 1.6 通过血清生化指标、套式PCR和ELISA对急性感染模型进行评估 | 第67-68页 |
| 1.7 弓形虫急性感染血清中循环抗原的免疫亲和层析 | 第68页 |
| 1.8 膜辅助蛋白样品制备 | 第68-69页 |
| 1.9 毛细管高效液相色谱 | 第69页 |
| 1.10 ESI质谱鉴定 | 第69页 |
| 1.11 ESI质谱数据分析 | 第69页 |
| 1.12 二维电泳(2-DE)和免疫印迹法 | 第69页 |
| 1.13 Western-blot鉴定 | 第69页 |
| 1.14 免疫反应点与蛋白点的匹配 | 第69-70页 |
| 1.15 胶内酶解及Ziptip脱盐 | 第70页 |
| 1.16 质谱分析 | 第70页 |
| 1.17 数据库检索 | 第70-71页 |
| 1.18 生物信息学分析 | 第71页 |
| 1.19 数据统计 | 第71页 |
| 2 试验结果 | 第71-84页 |
| 2.1 犬急性弓形虫感染动物模型的建立及其评价 | 第71-75页 |
| 2.2 通过免疫沉淀富集的循环抗原可以通过LC-MS/MS鉴定 | 第75页 |
| 2.3 免疫二位电泳结合MALDA-MS/MS可以鉴定循环抗原 | 第75页 |
| 2.4 蛋白质-蛋白质相互作用分析 | 第75-84页 |
| 3 讨论 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-91页 |
| 第五章 新型弓形虫循环抗原表达及其功能和免疫保护效果研究 | 第91-105页 |
| 1 材料与方法 | 第91-95页 |
| 1.1 实验动物与微生物 | 第91-92页 |
| 1.2 实验试剂 | 第92页 |
| 1.3 仪器 | 第92页 |
| 1.4 序列分析、引物的设计与合成 | 第92页 |
| 1.5 弓形虫RH株的收集及RNA的提取 | 第92页 |
| 1.6 基因的RT-PCR扩增 | 第92页 |
| 1.7 重组表达质粒的构建和鉴定 | 第92-93页 |
| 1.8 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第93页 |
| 1.9 重组蛋白的复性 | 第93页 |
| 1.10 重组蛋白的纯化 | 第93页 |
| 1.11 重组蛋白抗体的制备 | 第93页 |
| 1.12 急性感染模型血清中循环抗原的验证 | 第93页 |
| 1.13 免疫荧光试验 | 第93页 |
| 1.14 弓形虫入侵试验 | 第93-94页 |
| 1.15 四种蛋白对小鼠的保护性试验 | 第94页 |
| 1.16 绝对荧光定量PCR分析不同组织的载虫量 | 第94-95页 |
| 1.17 数据统计 | 第95页 |
| 2 结果 | 第95-101页 |
| 2.1 表达不同蛋白基因的RT-PCR扩增 | 第95页 |
| 2.2 Coronin、EMLO、eEF2和RPL40的表达和纯化 | 第95页 |
| 2.3 四种蛋白多克隆抗体的制备及其组织定位 | 第95页 |
| 2.4 Western-blot检测急性感染犬血液中的四种循环抗原 | 第95-97页 |
| 2.5 四种重组蛋白的抗体降低了刚地弓形虫的入侵效率 | 第97页 |
| 2.6 免疫四种重组蛋白可延长感染小鼠的存活时间 | 第97页 |
| 2.7 免疫四种重组蛋白可降低宿主血、肝、脾和脑部的载虫量 | 第97-101页 |
| 3 讨论 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-105页 |
| 第六章 重组弓形虫Coronin和ELMO蛋白在诊断弓形虫感染中的应用 | 第105-119页 |
| 1 材料与方法 | 第106-108页 |
| 1.1 实验试剂 | 第106页 |
| 1.2 仪器 | 第106页 |
| 1.3 进化树分析 | 第106页 |
| 1.4 通过棋盘法确定最佳的重组蛋白包被浓度及抗体稀释度 | 第106-107页 |
| 1.5 基于利用重组弓形虫Coronin蛋白检测血清IgG的ELISA诊断方法的建立 | 第107页 |
| 1.6 基于利用重组弓形虫ELMO蛋白检测血清IgG的ELISA诊断方法的建立 | 第107页 |
| 1.7 诊断效果评价 | 第107页 |
| 1.8 基于Coronin和ELMO多克隆抗体的急性感染诊断方法的建立 | 第107-108页 |
| 1.9 急性感染诊断方法的评价 | 第108页 |
| 2 结果 | 第108-114页 |
| 2.1 序列分析 | 第108页 |
| 2.2 棋盘法结果 | 第108页 |
| 2.3 重组蛋白对弓形虫感染的诊断效果 | 第108-109页 |
| 2.4 急性感染的诊断效果 | 第109-114页 |
| 3 讨论 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-119页 |
| 第七章 弓形虫硫氧还蛋白还原酶的表达、敲除及其功能研究 | 第119-155页 |
| 1 材料与方法 | 第120-132页 |
| 1.1 实验动物与微生物 | 第120页 |
| 1.2 实验试剂 | 第120-121页 |
| 1.3 仪器 | 第121页 |
| 1.4 RT-PCR扩增目的基因及生物信息学分析 | 第121页 |
| 1.5 表达载体的构建及鉴定 | 第121页 |
| 1.6 重组蛋白在大肠杆菌内的表达 | 第121-122页 |
| 1.7 重组蛋白的复性及纯化 | 第122页 |
| 1.8 重组蛋白多克隆抗体的制备 | 第122页 |
| 1.9 弓形虫硫氧还蛋白还原酶活性分析 | 第122-123页 |
| 1.10 免疫电镜检测 | 第123-124页 |
| 1.11 弓形虫TR基因敲除质粒的构建 | 第124-125页 |
| 1.12 CRISPR/CAS9质粒导入RH株弓形虫所需试剂的配制 | 第125-126页 |
| 1.13 CRISPR/CAS9质粒的扩增及提取 | 第126页 |
| 1.14 CRISPR/CAS9质粒转入弓形虫及单克隆虫株的筛选 | 第126页 |
| 1.15 基因敲除虫株的PCR鉴定 | 第126-127页 |
| 1.16 TR基因敲除后互补虫株的构建 | 第127-128页 |
| 1.17 间接免疫荧光 | 第128页 |
| 1.18 Western blotting | 第128页 |
| 1.19 弓形虫入侵试验 | 第128-129页 |
| 1.20 弓形虫增殖试验 | 第129页 |
| 1.21 弓形虫虫体活性氧检测 | 第129页 |
| 1.22 弓形虫虫体MDA水平检测 | 第129页 |
| 1.23 弓形虫细胞总抗氧化能力检测 | 第129-130页 |
| 1.24 H_2O_2对弓形虫体外增殖的影响 | 第130页 |
| 1.25 弓形虫不同接种数量与细胞感染率的关系 | 第130页 |
| 1.26 TR基因敲除对弓形虫刺激小鼠巨噬细胞和成纤维细胞产生的IL-5、IL-12、IFN-γ、NF-κB、TLR-2和TLR-4 mRNA水平的影响 | 第130-131页 |
| 1.27 TR敲除弓形虫对巨噬细胞ROS和NO水平的影响 | 第131页 |
| 1.28 小鼠巨噬细胞及成纤维细胞感染弓形虫后上清细胞因子的检测 | 第131-132页 |
| 1.29 TR敲除弓形虫感染小鼠后血清细胞因子的检测 | 第132页 |
| 1.30 TR敲除弓形虫的致死性试验 | 第132页 |
| 1.31 数据统计 | 第132页 |
| 2 结果 | 第132-148页 |
| 2.1 弓形虫硫氧还蛋白还原酶生物信息学分析结果 | 第132页 |
| 2.2 不同TR基因片段的RT-PCR扩增 | 第132-133页 |
| 2.3 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第133-135页 |
| 2.4 重组蛋白的纯化结果 | 第135页 |
| 2.5 三种重组硫氧还蛋白还原酶的3D结构预测 | 第135-136页 |
| 2.6 重组蛋白硫氧还蛋白还原酶活力的测定 | 第136-137页 |
| 2.7 不同pH对重组TR酶活性的影响 | 第137页 |
| 2.8 重组TR蛋白酶动力学试验 | 第137页 |
| 2.9 免疫电镜检测结果 | 第137-138页 |
| 2.10 质粒的测序结果 | 第138页 |
| 2.11 基因敲除及互补虫株的PCR鉴定结果 | 第138页 |
| 2.12 基因敲除后Western-blot结果 | 第138页 |
| 2.13 基因敲除后免疫荧光结果 | 第138页 |
| 2.14 敲除虫株体外入侵细胞的效率和增殖速度降低 | 第138页 |
| 2.15 TR-KO虫株细胞内ROS、MDA及总抗氧化能力 | 第138-139页 |
| 2.16 感染弓形虫后小鼠细胞中ROS水平检测 | 第139-144页 |
| 2.17 不同浓度的H2O2对TR敲除虫株增殖的影响 | 第144页 |
| 2.18 三种虫株促进小鼠巨噬细胞IL-12的表达 | 第144页 |
| 2.19 TR缺失株、互补株及野毒株感染BALB/c小鼠对细胞因子和存活时间的影响 | 第144-148页 |
| 3 讨论 | 第148-151页 |
| 3.1 弓形虫抗氧化系统的组成 | 第148-149页 |
| 3.2 活性氧在宿主细胞消灭弓形虫过程中发挥的作用 | 第149页 |
| 3.3 寄生虫抵抗宿主活性氧损伤的抗氧化系统 | 第149-150页 |
| 3.4 硫氧还蛋白还原酶在弓形虫抗氧化损伤中的作用 | 第150页 |
| 3.5 细胞因子参与抗弓形虫感染 | 第150-151页 |
| 参考文献 | 第151-155页 |
| 全文结论 | 第155-157页 |
| 本文创新点 | 第157-159页 |
| 致谢 | 第159-161页 |
| 攻读博士学位期间发表的科研成果 | 第161-163页 |
| 附录 | 第163-169页 |
