| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-29页 |
| 1.1 酯水解酶的研究概况 | 第12-16页 |
| 1.1.1 酯水解酶的简介 | 第12-13页 |
| 1.1.2 酯水解酶的催化机理 | 第13-14页 |
| 1.1.3 酯水解酶的分类 | 第14-15页 |
| 1.1.4 酯水解酶的来源 | 第15-16页 |
| 1.2 酯水解酶的应用 | 第16-21页 |
| 1.2.1 洗涤剂 | 第16-17页 |
| 1.2.2 纸浆和造纸业 | 第17页 |
| 1.2.3 食物原料 | 第17页 |
| 1.2.4 手性药物中间体 | 第17-21页 |
| 1.3 酯水解酶的分子改造 | 第21-25页 |
| 1.3.1 基于结构-功能分析的突变 | 第21-23页 |
| 1.3.2 迭代饱和突变 | 第23-24页 |
| 1.3.3 通过设计简并引物减少筛选量 | 第24页 |
| 1.3.4 基于结构比对的突变 | 第24-25页 |
| 1.4 适合酯水解酶对映选择性改造的高通量筛选方法 | 第25-28页 |
| 1.4.1 简单试剂 | 第25-26页 |
| 1.4.2 复杂试剂 | 第26-27页 |
| 1.4.3 复杂仪器 | 第27-28页 |
| 1.5 本论文的研究思路及内容提要 | 第28-29页 |
| 第二章 解淀粉芽孢杆菌酯酶的克隆表达及性能表征 | 第29-47页 |
| 2.1 前言 | 第29页 |
| 2.2 材料与方法 | 第29-38页 |
| 2.2.1 试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.2 菌株与质粒 | 第30页 |
| 2.2.3 溶液配制 | 第30-31页 |
| 2.2.4 实验方法 | 第31-38页 |
| 2.2.4.1 基因扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.4.2 双酶切 | 第32页 |
| 2.2.4.3 连接表达载体 | 第32页 |
| 2.2.4.4 连接产物的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.4.5 重组蛋白的表达 | 第33页 |
| 2.2.4.6 重组蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.4.7 蛋白含量测定 | 第34页 |
| 2.2.4.8 醋酶活力测定 | 第34页 |
| 2.2.4.9 重组BAE的酶学性质表征 | 第34页 |
| 2.2.4.10 发酵重组大肠杆菌制备BAE粗酶粉 | 第34-35页 |
| 2.2.4.11 外消旋仲醇酯的酶促对映选择性水解 | 第35-38页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第38-46页 |
| 2.3.1 解淀粉芽孢杆菌酯酶的克隆 | 第38页 |
| 2.3.2 解淀粉芽孢酯酶的核酸序列和氨基酸序列分析 | 第38-40页 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达与纯化 | 第40-41页 |
| 2.3.4 酯酶BAE的基本酶学催化性质 | 第41-45页 |
| 2.3.5 酯酶BAE催化拆分手性仲醇的性能 | 第45-46页 |
| 2.4 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 醇基多样性底物指纹谱的绘制和统计分析 | 第47-57页 |
| 3.1 前言 | 第47-48页 |
| 3.2 材料与方法 | 第48-50页 |
| 3.2.1 酶制剂 | 第48页 |
| 3.2.2 底物及其合成方法 | 第48页 |
| 3.2.3 检测方法 | 第48-50页 |
| 3.2.4 Q值校正和检测范围 | 第50页 |
| 3.2.5 Shannon-Wiener index指数计算 | 第50页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第50-56页 |
| 3.3.1 Q值的校正 | 第50-51页 |
| 3.3.2 检测范围 | 第51页 |
| 3.3.3 商品酶的底物指纹图谱绘制 | 第51-53页 |
| 3.3.4 不同酰基对活力的影响 | 第53-54页 |
| 3.3.5 实验室自制酶的底物指纹图谱绘制 | 第54-55页 |
| 3.3.6 指纹图谱的定量表征 | 第55-56页 |
| 3.4 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 BAE拆分手性仲醇以及其对映选择性的强化 | 第57-66页 |
| 4.1 前言 | 第57页 |
| 4.2 材料与方法 | 第57-59页 |
| 4.2.1 酰基的优化 | 第57页 |
| 4.2.2 表面活性剂的优化 | 第57-58页 |
| 4.2.3 反应温度的优化 | 第58页 |
| 4.2.4 底物/酶比例的优化 | 第58页 |
| 4.2.5 乙酸1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙酯的制备级酶促拆分 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-64页 |
| 4.3.1 酰基对酶对映选择性的影响 | 第59页 |
| 4.3.2 表面活性剂对酶促反应对映选择性的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.3 反应温度对酶促水解对映选择性的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.4 Tween-80和低温对酶促水解对映选择性的共同影响 | 第61-62页 |
| 4.3.5 底物/酶质量比对酶促反应对映选择性的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.6 乙酸1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙酯的制备级酶促拆分 | 第63-64页 |
| 4.4 本章小结 | 第64-66页 |
| 第五章 BAE酶的结构分析及选择性改造 | 第66-85页 |
| 5.1 前言 | 第66页 |
| 5.2 材料与方法 | 第66-70页 |
| 5.2.1 实验试剂 | 第66页 |
| 5.2.2 突变库的构建 | 第66-68页 |
| 5.2.3 深孔板培养 | 第68页 |
| 5.2.4 突变库筛选 | 第68-69页 |
| 5.2.5 突变体的动力学参数检测 | 第69-70页 |
| 5.2.6 BAE及突变体的同源建模和分子对接 | 第70页 |
| 5.2.7 突变体BAE-V10用于(R)-1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙醇的十克级酶促制备 | 第70页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第70-84页 |
| 5.3.1 突变“热点”的选择 | 第70-72页 |
| 5.3.2 构建突变库与建立筛选平台 | 第72-73页 |
| 5.3.3 突变路线 | 第73-74页 |
| 5.3.4 酶突变体的纯化和动力学检测 | 第74-75页 |
| 5.3.5 酶与底物的分子对接 | 第75-83页 |
| 5.3.6 突变体V10催化其他仲醇酯的对映选择性 | 第83页 |
| 5.3.7 制备级生物法拆分乙酸1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙酯 | 第83-84页 |
| 5.4 本章小结 | 第84-85页 |
| 第六章 总结与展望 | 第85-87页 |
| 6.1 主要结论 | 第85页 |
| 6.2 论文创新点 | 第85页 |
| 6.3 工作展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-97页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 附录 | 第99-101页 |
