| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1.1 酶的三维结构 | 第14-17页 |
| 1.1.1 蛋白质结构的测定 | 第14-15页 |
| 1.1.2 X-ray衍射晶体结构解析方法简介 | 第15-17页 |
| 1.2 环氧水解酶研究背景 | 第17-26页 |
| 1.2.1 环氧水解酶的结构分类与催化机理 | 第18-22页 |
| 1.2.2 环氧水解酶的开发和应用 | 第22-26页 |
| 1.3 环氧水解酶的分子改造 | 第26-32页 |
| 1.3.1 蛋白质工程的一般方法 | 第26-27页 |
| 1.3.2 定向进化 | 第27-28页 |
| 1.3.3 理性和半理性设计 | 第28-30页 |
| 1.3.4 环氧水解酶的分子改造 | 第30-32页 |
| 1.4 本课题的研究背景、目的及意义 | 第32-35页 |
| 1.5 本课题的研究思路及内容提要 | 第35-36页 |
| 第2章 BmEH晶体结构解析 | 第36-56页 |
| 2.1 本章引言 | 第36页 |
| 2.2 BmEH结构解析 | 第36-42页 |
| 2.2.1 BmEH表达纯化 | 第36-37页 |
| 2.2.2 BmEH结晶条件筛选及优化 | 第37-38页 |
| 2.2.3 BmEH衍射数据收集与处理 | 第38-39页 |
| 2.2.4 BmEH相角解析 | 第39-40页 |
| 2.2.5 BmEH结构解析及精修 | 第40-41页 |
| 2.2.6 BmEH母体晶体结构 | 第41-42页 |
| 2.3 BmEH复合物结构解析 | 第42-46页 |
| 2.3.1 BmEH小分子配体的选择 | 第42-44页 |
| 2.3.2 BmEH复合物晶体制备 | 第44-45页 |
| 2.3.3 BmEH复合物结构 | 第45-46页 |
| 2.4 BmEH反应过渡态中间体晶体结构解析 | 第46-48页 |
| 2.5 BmEH晶体结构分析 | 第48-54页 |
| 2.5.1 BmEH整体结构 | 第48-51页 |
| 2.5.2 BmEH复合物的结构 | 第51-53页 |
| 2.5.3 BmEH_(H267F)与底物复合物的结构 | 第53-54页 |
| 2.6 BmEH对映选择性的结构基础 | 第54-55页 |
| 2.7 本章小结 | 第55-56页 |
| 第3章 BmEH结构-功能关系 | 第56-72页 |
| 3.1 本章引言 | 第56-57页 |
| 3.2 BmEH的底物特异性 | 第57页 |
| 3.3 BmEH复合物结构分析 | 第57-60页 |
| 3.3.1 B因子分析 | 第57-59页 |
| 3.3.2 BmEH与其他环氧水解酶活性中心的比较 | 第59-60页 |
| 3.4 BmEH活性通道的功能分析 | 第60-62页 |
| 3.4.1 活性通道突变 | 第60-61页 |
| 3.4.2 通过捕捉催化反应中间体确定底物进入通道 | 第61-62页 |
| 3.5 BmEH底物特异性改造 | 第62-66页 |
| 3.5.1 BmEH活性通道的丙氨酸扫描 | 第62-63页 |
| 3.5.2 BmEH突变体的动力学表征 | 第63-64页 |
| 3.5.3 BmEH的荧光停流实验及中间体生成速率分析 | 第64-66页 |
| 3.6 BmEH突变体的晶体结构 | 第66-70页 |
| 3.6.1 BmEH_(F128A)及BmEH_(M145A)纯化结晶 | 第66-67页 |
| 3.6.2 BmEH_(F128A)与(R)-NPD复合物的晶体结构 | 第67-68页 |
| 3.6.3 BmEH_(M145A)的晶体结构 | 第68页 |
| 3.6.4 BmEH突变体的活性通道 | 第68-69页 |
| 3.6.5 产物释放过程分子动力学模拟 | 第69-70页 |
| 3.7 突变体BmEH_(M145A)的对映选择性分析 | 第70-71页 |
| 3.8 本章小结 | 第71-72页 |
| 第4章 BmEH突变体库的构建及其合成应用 | 第72-86页 |
| 4.1 本章引言 | 第72页 |
| 4.2 BmEH突变体的底物谱表征 | 第72-78页 |
| 4.2.1 BmEH突变体库的构建 | 第72-73页 |
| 4.2.2 BmEH突变体的活性表征 | 第73-75页 |
| 4.2.3 突变体纯酶的活性测定 | 第75-76页 |
| 4.2.4 突变体的动力学表征 | 第76-77页 |
| 4.2.5 BmEH的结构功能关系分析 | 第77-78页 |
| 4.3 对映选择性的测定 | 第78-84页 |
| 4.3.1 手性化合物绝对构型的确定 | 第79-82页 |
| 4.3.2 对映选择率测定及动力学分析 | 第82-84页 |
| 4.4 BmEH的合成应用 | 第84-85页 |
| 4.4.1 反应体系的选择 | 第84页 |
| 4.4.2 光学纯环氧的克级制备 | 第84-85页 |
| 4.5 本章小结 | 第85-86页 |
| 第5章 化学-酶法合成(R)-和(S)-普萘洛尔 | 第86-98页 |
| 5.1 本章引言 | 第86-87页 |
| 5.2 最适突变体的选择 | 第87-90页 |
| 5.2.1 突变体活性与选择性比较 | 第87-88页 |
| 5.2.2 BmEH突变体的稳定性 | 第88-89页 |
| 5.2.3 BmEH_(F128T)催化性能的表征 | 第89-90页 |
| 5.3 两相反应体系的优化 | 第90-93页 |
| 5.3.1 有机相溶剂的选择 | 第90-92页 |
| 5.3.2 两相体积比的优化 | 第92-93页 |
| 5.4 化学-酶法合成(R)-和(S)-普萘洛尔 | 第93-97页 |
| 5.4.1 最大底物上载量的考察 | 第93-94页 |
| 5.4.2 100 g/L_(total) rac-NGE的高效水解拆分 | 第94-96页 |
| 5.4.3 (R)-和(S)-普萘洛尔的合成 | 第96-97页 |
| 5.5 本章小结 | 第97-98页 |
| 第6章 实验材料与方法 | 第98-115页 |
| 6.1 实验材料和试剂 | 第98-103页 |
| 6.1.1 常用的试剂和材料 | 第98-99页 |
| 6.1.2 实验仪器 | 第99-100页 |
| 6.1.3 基因扩增引物 | 第100-101页 |
| 6.1.4 常用试剂配制 | 第101-103页 |
| 6.2 蛋白晶体结构的测定及分析 | 第103-106页 |
| 6.2.1 目标蛋白的过量表达 | 第103页 |
| 6.2.2 蛋白纯化 | 第103-104页 |
| 6.2.3 晶体生长条件的筛选及优化 | 第104-105页 |
| 6.2.4 晶体的X-ray衍射与数据收集 | 第105页 |
| 6.2.5 衍射数据处理及结构解析 | 第105-106页 |
| 6.2.6 结构分析及分子动力学模拟 | 第106页 |
| 6.3 酶的分子改造及功能表征 | 第106-109页 |
| 6.3.1 突变体构建 | 第106-107页 |
| 6.3.2 突变体的表达纯化 | 第107页 |
| 6.3.3 酶活检测 | 第107-108页 |
| 6.3.5 对映选择性测定 | 第108页 |
| 6.3.6 突变体稳定性的表征 | 第108页 |
| 6.3.7 蛋白质质谱分析 | 第108-109页 |
| 6.3.8 荧光停流实验 | 第109页 |
| 6.4 化合物的合成及表征 | 第109-112页 |
| 6.4.1 芳基缩水甘油醚类环氧底物的合成 | 第109-110页 |
| 6.4.2 萘基缩水甘油醚(NGE,9a)的扩大制备 | 第110-111页 |
| 6.4.3 化学法合成手性环氧底物 | 第111页 |
| 6.4.4 制备色谱手性拆分 | 第111页 |
| 6.4.5 环氧底物的化学水解 | 第111-112页 |
| 6.4.6 环氧及二醇绝对构型的确定 | 第112页 |
| 6.4.7 底物类似物PMT的合成 | 第112页 |
| 6.5 环氧水解酶的合成应用 | 第112-115页 |
| 6.5.1 两相体系中酶促动力学拆分消旋环氧化物 | 第112-113页 |
| 6.5.2 萘基缩水甘油醚(NGE)拆分反应体系的有机相组成优化 | 第113-114页 |
| 6.5.3 两相比例的优化 | 第114页 |
| 6.5.4 (S)-及(R)-普萘洛尔的制备 | 第114-115页 |
| 总结和展望 | 第115-118页 |
| 一 主要结论 | 第115-116页 |
| 二 论文创新点 | 第116页 |
| 三 展望 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-128页 |
| 附录 | 第128-142页 |
| 攻读博士期间论文发表及专利公开情况 | 第142-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
