| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第10-24页 |
| 1.1 立题背景及意义 | 第10-12页 |
| 1.2 葡糖杆菌属简介 | 第12-15页 |
| 1.2.1 葡糖杆菌的现状 | 第12页 |
| 1.2.2 葡糖杆菌的生物学特性 | 第12-13页 |
| 1.2.3 生产工业中葡糖杆菌的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.4 葡糖杆菌的污染现状及酸奶中的污染途径 | 第14-15页 |
| 1.3 葡糖杆菌检测方法的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.3.1 微生物分离鉴定方法 | 第15页 |
| 1.3.2 分子生物学检测方法 | 第15-16页 |
| 1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术及应用 | 第16-20页 |
| 1.4.1 LAMP方法概述 | 第16页 |
| 1.4.2 LAMP法的基本原理 | 第16-19页 |
| 1.4.3 LAMP法引物设计要素 | 第19页 |
| 1.4.4 LAMP技术在食品检测中的应用 | 第19-20页 |
| 1.5 SYBRGreen I实时荧光PCR技术 | 第20-23页 |
| 1.5.1 实时荧光定量PCR概述 | 第20-21页 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR技术原理 | 第21页 |
| 1.5.3 荧光染料SYBR Green I | 第21-22页 |
| 1.5.4 实时荧光定量PCR在食品检测中的应用 | 第22-23页 |
| 1.6 主要研究内容 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-32页 |
| 2.1 试验材料与仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.1 试验菌株 | 第24页 |
| 2.1.2 仪器与设备 | 第24页 |
| 2.1.3 主要试剂与培养基 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-26页 |
| 2.2.1 细菌的培养计数 | 第25页 |
| 2.2.2 细菌DNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.3 LAMP和qRT-PCR主要操作程序 | 第26-27页 |
| 2.3.1LAMP反应引物设计 | 第26页 |
| 2.3.2 LAMP反应体系和程序 | 第26-27页 |
| 2.3.3 qRT-PCR体系和程序 | 第27页 |
| 2.4 引物特异性的检测 | 第27页 |
| 2.4.1 LAMP引物特异性研究 | 第27页 |
| 2.4.2 q RT-PCR引物特异性研究 | 第27页 |
| 2.5 LAMP反应条件优化 | 第27-28页 |
| 2.5.1 LAMP反应最适温度的选择 | 第27页 |
| 2.5.2 LAMP反应中dNTPs浓度的筛选 | 第27页 |
| 2.5.3 LAMP反应中Mg2+浓度优化 | 第27-28页 |
| 2.5.4 LAMP反应中时间的优化 | 第28页 |
| 2.5.5 LAMP反应中引物对LAMP反应的影响 | 第28页 |
| 2.6 LAMP扩增产物的结果分析 | 第28页 |
| 2.6.1LAMP产物离心沉淀分析 | 第28页 |
| 2.6.2LAMP扩增产物添加SYBR Green I染料分析 | 第28页 |
| 2.6.3LAMP扩增产物酶切结果分析 | 第28页 |
| 2.7 qRT-PCR扩增产物的结果分析 | 第28-29页 |
| 2.7.1 q RT-PCR扩增过程的实时荧光曲线 | 第28-29页 |
| 2.7.2 q RT-PCR扩增产物的溶解曲线分析 | 第29页 |
| 2.8 葡糖杆菌纯菌液的灵敏度研究 | 第29页 |
| 2.8.1LAMP方法对葡糖杆菌灵敏度的确定 | 第29页 |
| 2.8.2 q RT-PCR反应的灵敏度检测 | 第29页 |
| 2.8.3 q RT-PCR扩增的标准曲线分析 | 第29页 |
| 2.8.4 PCR反应的灵敏度检测 | 第29页 |
| 2.9 人工污染酸奶中葡糖杆菌DNA模板提取方法的比较 | 第29-30页 |
| 2.9.1 普通热裂解法 | 第29-30页 |
| 2.9.2 直接试剂盒法 | 第30页 |
| 2.9.3 CTAB提取基因组DNA | 第30页 |
| 2.9.4 Triton X-100加热法 | 第30页 |
| 2.10 人工污染酸奶中葡糖杆菌的检出限测定 | 第30-31页 |
| 2.10.1 LAMP法检测人工污染葡糖杆菌样品的检出限 | 第30页 |
| 2.10.2 qRT-PCR法检测人工污染葡糖杆菌样品的检出限 | 第30-31页 |
| 2.11 模拟样品中葡糖杆菌的检测 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-46页 |
| 3.1 LAMP引物特异性的研究 | 第32-34页 |
| 3.1.1 LAMP方法验证引物特异性研究 | 第32页 |
| 3.1.2 q RT-PCR葡糖杆菌特异性结果 | 第32-34页 |
| 3.2LAMP反应条件的优化 | 第34-38页 |
| 3.2.1LAMP方法的最适合温度 | 第34-35页 |
| 3.2.2 Mg~(2+)浓度的选择 | 第35页 |
| 3.2.3 dNTPs浓度优化 | 第35-36页 |
| 3.2.4 LAMP反应时间的优化 | 第36-37页 |
| 3.2.5 引物比的优化 | 第37页 |
| 3.2.6 引物缺省对LAMP反应的影响 | 第37-38页 |
| 3.2.7 LAMP反应的最佳体系 | 第38页 |
| 3.3 检测葡糖杆菌菌液灵敏度的研究 | 第38-41页 |
| 3.3.1 LAMP法检测葡糖杆菌的灵敏度 | 第38-39页 |
| 3.3.2 qRT-PCR检测葡糖杆菌的灵敏度 | 第39-40页 |
| 3.3.3 qRT-PCR检测葡糖杆菌的标准曲线 | 第40-41页 |
| 3.4 LAMP扩增产物的分析 | 第41-43页 |
| 3.4.1 LAMP扩增产物的凝胶成像分析 | 第41页 |
| 3.4.2 可视性焦磷酸镁沉淀结果分析 | 第41页 |
| 3.4.3 SYBR GreenⅠ可视性分析 | 第41-42页 |
| 3.4.4 LAMP扩增产物酶切结果分析 | 第42-43页 |
| 3.5 人工污染酸奶中葡糖杆菌基因组DNA提取的方法比较 | 第43页 |
| 3.6 人工污染酸奶中测定葡糖杆菌的检出限 | 第43-45页 |
| 3.6.1 LAMP检测人工污染酸奶中葡糖杆菌的检出限 | 第43-44页 |
| 3.6.2 qRT-PCR检测人工污染酸奶中葡糖杆菌的检出限 | 第44-45页 |
| 3.7 检测模拟样品中的葡糖杆菌 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-50页 |
| 4.1 LAMP方法 | 第46-47页 |
| 4.1.1LAMP检测葡糖杆菌的方法学评价 | 第46页 |
| 4.1.2LAMP靶基因的确定及引物设计 | 第46-47页 |
| 4.1.3LAMP产物检测方法进一步研究建议 | 第47页 |
| 4.1.4LAMP方法的防污染措施 | 第47页 |
| 4.2 qRT-PCR方法 | 第47-48页 |
| 4.2.1 qRT-PCR检测葡糖杆菌的方法学评价 | 第47页 |
| 4.2.2 定量检测 | 第47-48页 |
| 4.2.3 qRT-PCR方法的溶解曲线分析 | 第48页 |
| 4.3 LAMP方法与qRT-PCR方法的比较 | 第48页 |
| 4.4 进一步检测酸奶中醋酸菌的方法建议 | 第48-50页 |
| 5 结论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-57页 |
| 硕士期间发表学术论文 | 第57-58页 |
| 作者简介 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
