| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-20页 |
| 1 银耳研究史 | 第11-12页 |
| ·银耳生活史 | 第11页 |
| ·银耳研究现状 | 第11-12页 |
| ·银耳栽培研究史 | 第11-12页 |
| ·银耳其他方面的研究 | 第12页 |
| 2 农杆菌介导转基因法在真菌中的研究 | 第12-15页 |
| ·根瘤农杆菌 | 第12页 |
| ·根瘤农杆菌介导转染机制 | 第12-13页 |
| ·T-DNA 导入真菌后的存在方式 | 第13-14页 |
| ·真菌转化过程中根瘤农杆菌的选择 | 第14-15页 |
| ·农杆菌介导转化的优点 | 第15页 |
| 3 胰岛素的研究进展 | 第15-18页 |
| ·胰岛素的结构与功能 | 第15-16页 |
| ·胰岛素提取纯化 | 第16页 |
| ·胰岛素的检测 | 第16-17页 |
| ·外源重组胰岛素的研究 | 第17-18页 |
| 4 外源基因表达产物检测方法的研究进展 | 第18-20页 |
| ·外源基因表产物检测的方法 | 第18页 |
| ·ELISA 法检测外源基因表达产物及当前研究进展 | 第18-20页 |
| 第二章 不同农杆菌介导转化银耳芽孢 | 第20-30页 |
| 1 材料与方法 | 第20-25页 |
| ·材料 | 第20-22页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20-21页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| ·碱裂解法提质粒溶液 | 第22页 |
| ·电泳缓冲液 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·仪器设备 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-25页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第22-23页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·冻融法转化农杆菌 | 第23-24页 |
| ·农杆菌菌落PCR 验证 | 第24页 |
| ·不同农杆菌介导外源基因转化银耳芽孢 | 第24-25页 |
| 2 结果与分析 | 第25-29页 |
| ·质粒转化各农杆菌 | 第25-26页 |
| ·不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳T121-01 | 第26-29页 |
| 3 讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳体系的优化 | 第30-46页 |
| 1 材料与方法 | 第30-32页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第30页 |
| ·培养基 | 第30页 |
| ·试剂 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-32页 |
| ·AS 在农杆菌诱导培养过程中浓度 | 第31页 |
| ·共培养中AS 浓度在 | 第31页 |
| ·共培养时间 | 第31页 |
| ·农杆菌浓度 | 第31-32页 |
| ·银耳芽孢浓度 | 第32页 |
| ·抗性菌落中阳性转化子比率 | 第32页 |
| 2 结果与分析 | 第32-45页 |
| ·AS 在农杆菌培养过程中诱导浓度的影响 | 第32-36页 |
| ·AS 浓度在共培养中的影响 | 第36-39页 |
| ·共培养时间 | 第39-41页 |
| ·农杆菌浓度 | 第41-42页 |
| ·银耳芽孢浓度 | 第42-43页 |
| ·抗性菌落中阳性转化子比率 | 第43-45页 |
| 3 讨论 | 第45-46页 |
| 第四章 人胰岛素基因银耳芽孢转化子验证 | 第46-57页 |
| 1 材料与方法 | 第46-50页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·供试菌株及质粒 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| ·CTAB 法提DNA 试剂 | 第46页 |
| ·引物 | 第46-47页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-50页 |
| ·CTAB 法提取基因组DNA | 第47-48页 |
| ·基因组DNA PCR 分析 | 第48-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-56页 |
| ·人胰岛素银耳转化子DNA 水平验证 | 第50-53页 |
| ·ITS 检测 | 第50-52页 |
| ·hph 基因 | 第52页 |
| ·人胰岛素基因BCA | 第52-53页 |
| ·RT-PCR | 第53-54页 |
| ·人胰岛素银耳转化菌株发酵期变异形态分析和验证 | 第54-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 第五章 银耳芽孢转化菌株中人胰岛素基因表达产物的检测 | 第57-73页 |
| 1 材料与方法 | 第57-61页 |
| ·材料 | 第57-59页 |
| ·供试菌株 | 第57-58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·银耳芽孢破碎缓冲液 | 第58页 |
| ·外源蛋白抽提缓冲液 | 第58页 |
| ·试剂 | 第58-59页 |
| ·仪器设备 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-61页 |
| ·转化子潮霉素抗性梯度实验 | 第59页 |
| ·银耳芽孢液氮破碎法 | 第59页 |
| ·银耳芽孢石英砂破碎法 | 第59-60页 |
| ·银耳芽孢高渗酶解法 | 第60页 |
| ·人胰岛素表达产物抽提 | 第60页 |
| ·人胰素抗原的双抗体夹心法 | 第60-61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-71页 |
| ·转化子菌株潮霉素梯度抗性实验 | 第61-63页 |
| ·胰岛素注射液ELISA 检测 | 第63-64页 |
| ·不同银耳芽孢破碎方法对ELISA 检测结果的影响 | 第64-65页 |
| ·石英砂破碎银耳芽孢ELISA 法验证 | 第65-66页 |
| ·人胰岛素基因表达菌株ELISA 初步筛选 | 第66-68页 |
| ·外源人胰岛素基因表达菌株的重复性验证 | 第68-70页 |
| ·人胰岛素表达菌株和潮霉素抗性之间的关系分析 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-73页 |
| 缩略词 | 第73-74页 |
| 附录1 质粒图谱 | 第74页 |
| 附录2 DL2000Mark | 第74-75页 |
| 附录3 启动子及基因序列 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
