| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-21页 |
| 1.1 转酮酶综述 | 第10-11页 |
| 1.2 转酮酶的催化机制 | 第11-12页 |
| 1.3 转酮酶的稳定性 | 第12-13页 |
| 1.4 转酮酶辅酶与底物结合相关位点 | 第13-14页 |
| 1.5 转酮酶生物催化研究方法概论 | 第14-16页 |
| 1.6 酶的定向进化概论 | 第16-17页 |
| 1.7 转酮酶的底物谱和转酮酶的定向进化 | 第17-19页 |
| 1.7.1 转酮酶的底物谱 | 第17-18页 |
| 1.7.2 改造转酮酶提高其对非磷酸化底物的催化活性 | 第18页 |
| 1.7.3 改造转酮酶提高其对α位无羟基脂肪醛类受体底物的催化活性 | 第18-19页 |
| 1.8 本研究的基础与意义 | 第19-21页 |
| 第2章 三个转酮酶的表达及酶学性质鉴定 | 第21-39页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 材料 | 第21-24页 |
| 2.2.1 三个耐热转酮酶基因 | 第21页 |
| 2.2.2 克隆转酮酶基因用到的工具酶以及试剂盒 | 第21页 |
| 2.2.3 扩增转酮酶基因引物的设计和引物合成 | 第21-22页 |
| 2.2.4 感受态细胞与克隆所需载体 | 第22页 |
| 2.2.5 本章节用到的培养基 | 第22页 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE凝胶电泳 | 第22页 |
| 2.2.7 蛋白纯化所需试剂 | 第22页 |
| 2.2.8 转酮酶底物谱测定所需试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.9 本章所用到的仪器与试剂清单列表 | 第23-24页 |
| 2.3 方法 | 第24-34页 |
| 2.3.1 从BL21(DE3)中提取含有TK基因的质粒 | 第24-25页 |
| 2.3.2 三个耐热转酮酶基因的扩增 | 第25-26页 |
| 2.3.4 PCR体系中质粒模板的切除 | 第26页 |
| 2.3.5 PCR产物胶回收纯化 | 第26页 |
| 2.3.6 PCR产物与亚克隆载体的连接 | 第26-27页 |
| 2.3.7 含有TK基因的亚克隆质粒载体的转化 | 第27页 |
| 2.3.8 克隆载体的小体系双酶酶切验证 | 第27-28页 |
| 2.3.9 酶切构建成功的亚克隆质粒与表达质粒空载pET21a (+) | 第28页 |
| 2.3.10 胶回收2.3.9中的酶切产物 | 第28页 |
| 2.3.11 表达质粒与TK基因的连接与转化 | 第28页 |
| 2.3.12 将表达质粒转入BL21(DE3)中 | 第28页 |
| 2.3.13 三个耐热转酮酶基因的可溶性表达验证 | 第28-29页 |
| 2.3.14 SDS-PAGE变性蛋白胶的配制以及蛋白电泳方法 | 第29-30页 |
| 2.3.15 可溶性蛋白的发酵罐水平表达与纯化 | 第30页 |
| 2.3.16 蛋白纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.17 蛋白浓度的测定(Bradford法) | 第31页 |
| 2.3.18 供体底物Li-HPA的合成 | 第31-32页 |
| 2.3.19 酶学性质-底物谱测定 | 第32页 |
| 2.3.20 碳酸氢根离子标准曲线的绘制 | 第32-33页 |
| 2.3.21 以pH-Base的方法对TK456、TK465、TK2542三个酶的底物性质进行测定 | 第33-34页 |
| 2.4 结果分析与讨论 | 第34-37页 |
| 2.4.1 三个耐热性转酮酶基因表达菌株的构建 | 第34-36页 |
| 2.4.2 三个耐热性转酮酶基因的可溶性表达验证结果 | 第36-37页 |
| 2.4.3 合成的LiHPA NMR谱图见附件 | 第37页 |
| 2.4.4 转酮酶的酶学性质测定结果 | 第37页 |
| 2.5 小结 | 第37-39页 |
| 第3章 转酮酶定向进化库的建立与高通量筛选 | 第39-51页 |
| 3.1 引言 | 第39-40页 |
| 3.2 材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1 本章节涉及到的网站与所用到的软件 | 第40页 |
| 3.2.2 本章节涉及到的试剂盒与感受态细胞 | 第40页 |
| 3.2.3 筛选突变库所需要的试剂与仪器、耗材清单 | 第40-41页 |
| 3.3 方法 | 第41-45页 |
| 3.3.1 TK456晶体结构模拟 | 第41页 |
| 3.3.2 晶体结构分析 | 第41页 |
| 3.3.3 利用QuikChange技术对选定的氨基酸残基进行饱和突变 | 第41-42页 |
| 3.3.4 突变库的建立 | 第42-43页 |
| 3.3.5 调单克隆突变体于浅层96孔圆底细胞培养板中 | 第43-44页 |
| 3.3.6 第一轮初筛 | 第44-45页 |
| 3.3.7 第二轮复筛 | 第45页 |
| 3.3.8 第三轮筛选 | 第45页 |
| 3.3.9 测序、确定筛到的突变体 | 第45页 |
| 3.4 结果分析与讨论 | 第45-49页 |
| 3.4.1 转酮酶的晶体结构的活性口袋模拟结果 | 第45-46页 |
| 3.4.2 利用QuikChange进行饱和突变结果 | 第46页 |
| 3.4.3 利用两种模式底物对所建立的饱和突变库高通量筛选 | 第46-47页 |
| 3.4.4 阳性突变体的测序结果 | 第47-49页 |
| 3.4.5 讨论 | 第49页 |
| 3.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 阳性突变体的酶学性质鉴定 | 第51-64页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 材料 | 第51-52页 |
| 4.3 方法 | 第52-56页 |
| 4.3.1 甲氧基乙醛的合成 | 第52-53页 |
| 4.3.2 45个阳性突变体的酶活力测定 | 第53-54页 |
| 4.3.3 阳性突变体的热稳定测定 | 第54-55页 |
| 4.3.4 阳性突变体催化底物的立体选择性测定 | 第55-56页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第56-62页 |
| 4.4.1 阳性突变体的酶活测定结果和T_m值测定结果 | 第56-59页 |
| 4.4.2 阳性突变体催化丙醛ee值测定结果 | 第59-62页 |
| 4.5 本章小结 | 第62-64页 |
| 第5章 阳性突变体生物催化合成验证 | 第64-72页 |
| 5.1 引言 | 第64-65页 |
| 5.2 实验试剂和相关仪器设备 | 第65页 |
| 5.3 实验方法 | 第65-67页 |
| 5.3.1 酶的制备 | 第65页 |
| 5.3.2 催化反应 | 第65-67页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第67-72页 |
| 第6章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 6.1 课题总结 | 第72-73页 |
| 6.2 课题展望 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-80页 |
| 参考文献 | 第80-85页 |
| 已投稿或待发表的科研成果 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
