| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第12-24页 |
| 1.1 RBSDV的研究进展 | 第12-16页 |
| 1.1.1 RBSDV发生、分布及危害 | 第12页 |
| 1.1.2 RBSDV寄主、以及传毒介体 | 第12-13页 |
| 1.1.3 RBSDV分类地位以及病毒粒子 | 第13页 |
| 1.1.4 RBSDV基因组结构 | 第13-14页 |
| 1.1.5 RBSDV基因组编码的蛋白质 | 第14-16页 |
| 1.2 实验中用到的主要技术 | 第16-21页 |
| 1.2.1 酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid system,YTHS) | 第16-18页 |
| 1.2.2 双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC) | 第18-19页 |
| 1.2.3 CRISPR-CAS技术 | 第19-21页 |
| 1.3 CSN5B基因研究进展 | 第21-23页 |
| 1.3.1 COP9信号复合体(CSN) | 第21页 |
| 1.3.2 植物泛素化(Ubiquitin)的相关研究 | 第21-22页 |
| 1.3.3 CSN5研究进展 | 第22-23页 |
| 1.4 选题的目的与意义 | 第23-24页 |
| 第二章 RBSDV p5-1与OsCSN5B互作验证 | 第24-38页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.3 实验中使用的方法 | 第25-33页 |
| 2.3.1 实验中使用的引物 | 第25页 |
| 2.3.2 PCR扩增目的基因 | 第25-26页 |
| 2.3.3 PCR产物的检测与回收 | 第26-27页 |
| 2.3.4 目的基因连接入门载体(BP反应) | 第27-28页 |
| 2.3.5 转化大肠杆菌 | 第28页 |
| 2.3.6 阳性克隆的鉴定及筛选 | 第28页 |
| 2.3.7 小抽提取大肠杆菌质粒 | 第28-29页 |
| 2.3.8 目的基因连接到目的载体上(LR反应) | 第29页 |
| 2.3.9 目的基因连接T载体 | 第29-30页 |
| 2.3.10 目的基因连接表达以及重组载体 | 第30页 |
| 2.3.11 测序及序列比对 | 第30页 |
| 2.3.12 质粒双酶切鉴定 | 第30页 |
| 2.3.13 一对质粒共转化酵母菌株 | 第30-31页 |
| 2.3.14 酵母菌株质粒的提取 | 第31-32页 |
| 2.3.15 提取烟草蛋白 | 第32页 |
| 2.3.16 蛋白质杂交(Western blotting) | 第32-33页 |
| 2.4 实验结果分析与讨论 | 第33-37页 |
| 2.4.1 酵母互作验证 | 第33-34页 |
| 2.4.2 免疫共沉淀分析 | 第34-35页 |
| 2.4.3 OsCSN5B与RBSDV p5-1互作结构域的分析 | 第35-37页 |
| 2.5 本章总结与讨论 | 第37-38页 |
| 第三章 RBSDV p5-1与OsCSN5B互作生物学功能初步分析 | 第38-48页 |
| 3.1 引言 | 第38页 |
| 3.2 实验材料 | 第38-39页 |
| 3.3 实验方法 | 第39-42页 |
| 3.3.1 PCR扩增目的基因 | 第39页 |
| 3.3.2 连接T载体以及表达载体 | 第39页 |
| 3.3.3 农杆菌感受态的制备 | 第39页 |
| 3.3.4 重组质粒电击转化进入农杆菌感受态细胞 | 第39页 |
| 3.3.5 农杆菌浸润接种 | 第39-40页 |
| 3.3.6 激光共聚焦显微镜观察荧光 | 第40页 |
| 3.3.7 提取烟草RNA(叶片中含有较多酚类物质) | 第40页 |
| 3.3.8 RNA核苷酸杂交(Northern blotting) | 第40-41页 |
| 3.3.9 植物蛋白提取以及Western blotting实验 | 第41-42页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第42-47页 |
| 3.4.1 OsCSN5B和p5-1亚细胞定位和共定位分析 | 第42-43页 |
| 3.4.2 不同浓度的OsCSN5B对于p5-1的定位形态有着显著的影响 | 第43-45页 |
| 3.4.3 OsCSN5B和p5-1过表达对于ToMV复制影响 | 第45-47页 |
| 3.5 本章总结与讨论 | 第47-48页 |
| 第四章 水稻CSN5B基因抗血清制备和应用 | 第48-57页 |
| 4.1 引言 | 第48页 |
| 4.2 实验材料 | 第48页 |
| 4.3 实验方法 | 第48-51页 |
| 4.3.1 本章节实验所用的引物 | 第48-49页 |
| 4.3.2 Trizol法提取水稻总RNA | 第49页 |
| 4.3.3 逆转录 | 第49-50页 |
| 4.3.4 水稻“日本晴”CSN5B基因克隆 | 第50页 |
| 4.3.5 PCR产物回收纯化 | 第50页 |
| 4.3.6 水稻“日本晴”CSN5B基因连接pEASYTM-T5载体 | 第50页 |
| 4.3.7 水稻“日本晴”CSN5B基因连接重组载体 | 第50页 |
| 4.3.8 水稻“日本晴”CSN5B基因诱导表达和抗血清制备 | 第50页 |
| 4.3.9 蛋白质杂交 | 第50页 |
| 4.3.10 实时荧光定量PCR | 第50-51页 |
| 4.4 实验内容与结果 | 第51-55页 |
| 4.4.1 OsCSN5B基因T载体和表达载体构建 | 第51-52页 |
| 4.4.2 OsCSN5B蛋白的诱导以及条件的优化 | 第52-53页 |
| 4.4.3 OsCSN5B蛋白纯化 | 第53-54页 |
| 4.4.4 OsCSN5B蛋白抗血清的制备和初步应用 | 第54-55页 |
| 4.4.5 RBSDV侵染水稻后OsCSN5B在mRNA水平表达量的变化 | 第55页 |
| 4.5 总结与讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 OsCSN5B干涉水稻株系的获得和筛选 | 第57-64页 |
| 5.1 引言 | 第57页 |
| 5.2 实验材料 | 第57页 |
| 5.3 实验方法 | 第57-60页 |
| 5.3.1 CRISPR/Cas9体系中敲除位点的选择 | 第57-58页 |
| 5.3.2 CRISPR/Cas9体系中导向RNA(gRNA)设计与合成 | 第58页 |
| 5.3.3 植物cas9/gRNA质粒构建试剂盒使用方法 | 第58-59页 |
| 5.3.4 连接产物转化大肠杆菌 | 第59页 |
| 5.3.5 挑选阳性克隆 | 第59页 |
| 5.3.6 少量提取质粒并转化农杆菌 | 第59页 |
| 5.3.7 水稻DNA提取 | 第59页 |
| 5.3.8 PCR检测 | 第59-60页 |
| 5.3.9 对转基因得到T0代植株的目的基因特定区域的突变进行鉴定 | 第60页 |
| 5.4 实验结果 | 第60-63页 |
| 5.4.1 设计设计CRISPR/Cas9系统敲除位点 | 第60页 |
| 5.4.2 扩增gRNA序列所用的引物 | 第60-61页 |
| 5.4.3 B1、B2和B3 CRISPR/Cas9克隆载体的遗传转化 | 第61-62页 |
| 5.4.4 鉴定出阳性的转基因水稻植株 | 第62页 |
| 5.4.5 对T0代转基因阳性水稻株系目的基因的特定区域的突变进行鉴定 | 第62-63页 |
| 5.5 总结与讨论 | 第63-64页 |
| 第六章 总结和展望 | 第64-66页 |
| 6.1 总结 | 第64页 |
| 6.2 展望 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 附录 | 第74-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 作者简介 | 第83页 |
