| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 文献综述 | 第13-34页 |
| 第一章 BHD综合征与FLCN研究进展 | 第13-22页 |
| 1.1 BHD综合征 | 第13页 |
| 1.2 BHD综合征与FLCN的关系 | 第13-14页 |
| 1.3 FLCN蛋白的结构 | 第14-15页 |
| 1.4 FLCN的表达 | 第15-16页 |
| 1.5 FLCN的功能 | 第16-19页 |
| 1.5.1 与FLCN相结合的蛋白 | 第16-17页 |
| 1.5.2 FLCN蛋白相关的信号通路 | 第17-19页 |
| 1.6 研究BHD综合征的动物模型 | 第19-22页 |
| 第二章 mTORC1信号通路 | 第22-34页 |
| 2.1 mTOR信号通路简介 | 第22-23页 |
| 2.2 mTOR复合物 1（mTORC1）研究进展 | 第23-28页 |
| 2.2.1 氨基酸介导mTOR信号通路 | 第24-28页 |
| 2.3 mTOR信号通路的生物学功能 | 第28-30页 |
| 2.3.1 mTOR信号通路调控细胞生长 | 第28-29页 |
| 2.3.2 mTOR信号通路调控细胞蛋白质合成 | 第29页 |
| 2.3.3 mTOR信号通路调控细胞脂质的合成 | 第29-30页 |
| 2.3.4 mTOR信号通路调控细胞糖酵解 | 第30页 |
| 2.3.5 mTOR信号通路调控细胞自噬 | 第30页 |
| 2.4 mTOR信号通路与疾病 | 第30-33页 |
| 2.4.1 mTOR信号通路与肿瘤 | 第31页 |
| 2.4.2 mTOR信号与代谢紊乱 | 第31-32页 |
| 2.4.3 mTOR信号与神经系统疾病 | 第32页 |
| 2.4.4 mTOR信号与炎症 | 第32-33页 |
| 2.5 本项工作的前期研究结果 | 第33-34页 |
| 试验研究 | 第34-86页 |
| 第三章 高浓度亮氨酸可以挽救抑制FLCN引起的mTORC1下调 | 第34-52页 |
| 3.1 材料 | 第34-35页 |
| 3.1.1 细胞和载体 | 第34页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第34-35页 |
| 3.2 实验方法 | 第35-42页 |
| 3.2.1 FLCN慢病毒干扰载体的构建、包装和鉴定 | 第35-38页 |
| 3.2.2 重组慢病毒颗粒的包装 | 第38-41页 |
| 3.2.3 高浓度氨基酸处理 | 第41-42页 |
| 3.3 实验结果 | 第42-51页 |
| 3.3.1 FLCN慢病毒干扰载体的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.2 慢病毒包装质粒和包膜质粒的扩增鉴定 | 第43页 |
| 3.3.3 慢病毒载体的包装 | 第43-44页 |
| 3.3.4 病毒滴度测定 | 第44-45页 |
| 3.3.5 慢病毒感染HEK293细胞 | 第45-46页 |
| 3.3.6 荧光定量PCR检测FLCN转录水平的表达变化 | 第46-47页 |
| 3.3.7 Western blot检测FLCN蛋白水平的表达变化 | 第47页 |
| 3.3.8 高浓度亮氨酸拮抗FLCN抑制引起的mTORC1下调 | 第47-48页 |
| 3.3.9 FLCN特异性介导亮氨酸激活mTORC1信号 | 第48-49页 |
| 3.3.10 抑制FLCN导致mTORC1对亮氨酸信号水平更敏感 | 第49-51页 |
| 3.4 讨论 | 第51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 FLCN调控溶酶体内亮氨酸水平 | 第52-69页 |
| 4.1 材料 | 第52-53页 |
| 4.1.1 细胞、载体和抗体 | 第52页 |
| 4.1.2 主要试验试剂配制 | 第52-53页 |
| 4.2 实验方法与步骤 | 第53-57页 |
| 4.2.1 细胞的培养与转染 | 第53页 |
| 4.2.2 细胞饥饿处理 | 第53-54页 |
| 4.2.3 shFLCN慢病毒感染细胞与 50×Leu的添加 | 第54页 |
| 4.2.4 细胞免疫荧光染色 | 第54页 |
| 4.2.5 溶酶体提取与纯化 | 第54-57页 |
| 4.3 实验结果 | 第57-66页 |
| 4.3.1 FLCN在溶酶体上的分布 | 第57页 |
| 4.3.2 氨基酸饥饿时，FLCN在溶酶体上富集 | 第57-59页 |
| 4.3.3 FLCN调控溶酶体亮氨酸水平 | 第59-63页 |
| 4.3.4 过表达FLCN使细胞溶酶体亮氨酸维持较高水平 | 第63-66页 |
| 4.4 讨论 | 第66-67页 |
| 4.5 小结 | 第67-69页 |
| 第五章 FLCN与PAT1相互拮抗调节mTORC1 | 第69-75页 |
| 5.1 材料 | 第69-70页 |
| 5.1.1 细胞、载体和抗体 | 第69页 |
| 5.1.2 引物序列 | 第69-70页 |
| 5.1.3 si RNA序列 | 第70页 |
| 5.2 实验方法和步骤 | 第70-71页 |
| 5.2.1 细胞饥饿处理 | 第70页 |
| 5.2.2 细胞的准备与si RNA干扰处理 | 第70-71页 |
| 5.2.3 细胞总RNA提取与逆转录 | 第71页 |
| 5.2.4 实时定量PCR（qPCR）反应 | 第71页 |
| 5.3 实验结果 | 第71-73页 |
| 5.3.1 FLCN拮抗PAT1对mTORC1的调控作用 | 第71-72页 |
| 5.3.2 FLCN不影响PAT4调控mTORC1的功能 | 第72-73页 |
| 5.4 讨论 | 第73-74页 |
| 5.5 小结 | 第74-75页 |
| 第六章 FLCN调节PAT1在溶酶体上的分布 | 第75-86页 |
| 6.1 材料 | 第75页 |
| 6.1.1 细胞、载体和抗体 | 第75页 |
| 6.2 实验方法和步骤 | 第75-77页 |
| 6.2.1 细胞系培养与转染 | 第75-76页 |
| 6.2.2 细胞的准备与si RNA干扰处理 | 第76页 |
| 6.2.3 细胞饥饿处理 | 第76页 |
| 6.2.4 细胞免疫荧光染色 | 第76页 |
| 6.2.5 溶酶体提取与纯化 | 第76页 |
| 6.2.6 蛋白免疫共沉淀试验 | 第76-77页 |
| 6.3 实验结果 | 第77-83页 |
| 6.3.1 抑制FLCN促进溶酶体对PAT1的募集 | 第77-79页 |
| 6.3.2 高表达FLCN阻止PAT1在溶酶体的募集 | 第79-81页 |
| 6.3.3 FLCN与PAT1共定位 | 第81-83页 |
| 6.4 讨论 | 第83-85页 |
| 6.5 小结 | 第85-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 创新点和进一步研究计划 | 第87-88页 |
| 创新点 | 第87页 |
| 进一步研究计划 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-101页 |
| 缩略词 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 作者简介 | 第103页 |
