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Shewanella algae和Arthrobacter nicotianae中丝氨酸羟甲基转移酶酶学性质的分析、定向进化及应用

摘要第1-9页
Abstract第9-11页
缩略语表第11-12页
1 前言第12-26页
   ·丝氨酸制备方法及应用第12-19页
     ·丝氨酸的应用第12-13页
     ·丝氨酸制备方法第13-19页
   ·SHMT的研究背景第19-20页
     ·植物体中SHMT第19页
     ·动物体中SHMT第19-20页
     ·微生物体中SHMT第20页
   ·glyA的克隆技术第20-23页
   ·同源建模及定点突变的意义第23-24页
     ·同源建模的原理第23-24页
     ·SHMT定点突变的作用第24页
   ·本研究的目的和意义及论文创新点第24-26页
2 材料与方法第26-54页
   ·质粒与菌株第26页
   ·主要试剂和器材第26-28页
   ·PCR引物序列第28-29页
   ·培养基第29-30页
   ·实验所用溶液第30-32页
   ·SHMT酶活测定原理及方法第32-33页
     ·苯甲醛标准曲线的绘制第32-33页
     ·SHMT酶活测定的原理及方法第33页
   ·筛选具有高活性SHMT菌株的方法第33页
   ·大肠杆菌感受态细胞的制备第33-34页
   ·海洋菌Shewanella algae中glyA基因的扩增第34-38页
     ·目标基因S.algae glyA保守序列分析及扩增第34-35页
     ·扩增S.algae glyA保守区域左右两端序列第35-37页
     ·序列拼接及获取S.algae glyA完整序列第37-38页
   ·淡水菌Arthrobacter nicotianae中glyA基因的克隆第38-42页
     ·Arthrobacter属中glyA基因两端保守序列的分析第38-39页
     ·利用兼并引物扩增A.nicotianae glyA基因第39-40页
     ·TA克隆及获得A.nicotianae glyA基因的完整序列第40页
     ·pGEX-6p-1的提取及载体的构建第40页
     ·AnglyA基因片段的扩增、酶切及纯化第40-41页
     ·酶连及电转第41-42页
     ·pGEX-6p-SaglyA和pGEX-6p-AnglyA质粒提取及检测第42页
   ·两种细菌SHMT的异源表达及纯化第42-44页
     ·SaSHMT和AnSHMT的表达第42-44页
     ·SHMT和AnSHMT的纯化及SDS-PAGE电泳第44页
   ·SHMT酶学性质测定第44-46页
     ·SHMT和AnSHMT酶学性质的测定第44-46页
   ·静息细胞法生产L-丝氨酸第46页
     ·静息细胞反应条件及体系第46页
     ·体系中L-丝氨酸的检测-DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析法第46页
     ·高效液相色谱HPLC检测体系中L-丝氨酸的含量第46页
   ·利用酶促转化法生产L-丝氨酸第46-50页
     ·菌株的选择及工程菌的构建第46-47页
     ·THFA的化学合成第47页
     ·测定两种工程菌的生物量第47页
     ·酶促转化法生产L-丝氨酸的条件及体系第47-48页
     ·高效液相色谱HPLC检测体系中L-丝氨酸的含量第48-50页
   ·两种工程菌SaSHMT和EcSHMT生产能力的对比第50-51页
   ·AnglyA的定点突变第51-54页
     ·序列比对分析及模拟三维结构确定突变位点第51-52页
     ·引物设计第52-53页
     ·定点突变及检测第53-54页
     ·突变子酶学性质及动力学的检测第54页
3 结果与分析第54-74页
   ·Shewanella algae中glyA基因序列的获得第54-58页
     ·SaglyA保守区域序列第54-55页
     ·保守区域两端序列第55页
     ·SaglyA全长序列第55-56页
     ·SaglyA和SaSHMT的序列分析第56-57页
     ·SaSHMT与不同物种SHMT的进化关系分析第57-58页
   ·Arthrobacter nicotianae中glyA基因的克隆第58-60页
     ·两端简并引物的设计及A.nicotianae glyA基因的扩增第58页
     ·TA克隆及获得A.nicotianae glyA基因的完整序列第58-59页
     ·AnglyA和AnSHMT的序列分析第59-60页
     ·AnSHMT与不同物种SHMT的进化关系分析第60页
   ·两种细菌SHMT的异源表达及纯化第60-62页
     ·构建蛋白表达系统第60-61页
     ·蛋白表达、纯化及SDS-PAGE电泳分析第61-62页
   ·SHMT酶学性质测定第62-69页
     ·苯甲醛标准曲线的绘制第62页
     ·SaSHMT的酶学性质第62-65页
     ·AnSHMT的酶学性质及其与I249L-SHMT酶学性质的比较第65-69页
   ·运用静息细胞方法生产L-丝氨酸第69-70页
   ·利用酶促转化法生产L-丝氨酸第70-73页
     ·测定两种工程菌的生物量第70页
     ·酶促转化法生产L-丝氨酸及HPLC检测体系中L-丝氨酸的产量第70-73页
   ·AnSHMT的定点突变第73-74页
     ·定点突变及结果检测第73-74页
     ·突变子的酶学性质分析第74页
4 结果与讨论第74-78页
   ·glyA基因序列的获得第74-75页
   ·SHMTs的酶学性质分析第75页
   ·工程菌pET-15b-SaSHMT和pET-15b-EcSHMT表达及酶活力比较第75页
   ·工程菌pET-15b-SaSHMT产酸能力分析及其与pET-15b-EcSHMT生产能力的比较第75-76页
   ·AnSHMT定点突变的讨论第76-77页
   ·工作展望第77-78页
参考文献第78-84页
研究成果第84-85页
致谢第85页

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