| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| ·丝氨酸制备方法及应用 | 第12-19页 |
| ·丝氨酸的应用 | 第12-13页 |
| ·丝氨酸制备方法 | 第13-19页 |
| ·SHMT的研究背景 | 第19-20页 |
| ·植物体中SHMT | 第19页 |
| ·动物体中SHMT | 第19-20页 |
| ·微生物体中SHMT | 第20页 |
| ·glyA的克隆技术 | 第20-23页 |
| ·同源建模及定点突变的意义 | 第23-24页 |
| ·同源建模的原理 | 第23-24页 |
| ·SHMT定点突变的作用 | 第24页 |
| ·本研究的目的和意义及论文创新点 | 第24-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-54页 |
| ·质粒与菌株 | 第26页 |
| ·主要试剂和器材 | 第26-28页 |
| ·PCR引物序列 | 第28-29页 |
| ·培养基 | 第29-30页 |
| ·实验所用溶液 | 第30-32页 |
| ·SHMT酶活测定原理及方法 | 第32-33页 |
| ·苯甲醛标准曲线的绘制 | 第32-33页 |
| ·SHMT酶活测定的原理及方法 | 第33页 |
| ·筛选具有高活性SHMT菌株的方法 | 第33页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| ·海洋菌Shewanella algae中glyA基因的扩增 | 第34-38页 |
| ·目标基因S.algae glyA保守序列分析及扩增 | 第34-35页 |
| ·扩增S.algae glyA保守区域左右两端序列 | 第35-37页 |
| ·序列拼接及获取S.algae glyA完整序列 | 第37-38页 |
| ·淡水菌Arthrobacter nicotianae中glyA基因的克隆 | 第38-42页 |
| ·Arthrobacter属中glyA基因两端保守序列的分析 | 第38-39页 |
| ·利用兼并引物扩增A.nicotianae glyA基因 | 第39-40页 |
| ·TA克隆及获得A.nicotianae glyA基因的完整序列 | 第40页 |
| ·pGEX-6p-1的提取及载体的构建 | 第40页 |
| ·AnglyA基因片段的扩增、酶切及纯化 | 第40-41页 |
| ·酶连及电转 | 第41-42页 |
| ·pGEX-6p-SaglyA和pGEX-6p-AnglyA质粒提取及检测 | 第42页 |
| ·两种细菌SHMT的异源表达及纯化 | 第42-44页 |
| ·SaSHMT和AnSHMT的表达 | 第42-44页 |
| ·SHMT和AnSHMT的纯化及SDS-PAGE电泳 | 第44页 |
| ·SHMT酶学性质测定 | 第44-46页 |
| ·SHMT和AnSHMT酶学性质的测定 | 第44-46页 |
| ·静息细胞法生产L-丝氨酸 | 第46页 |
| ·静息细胞反应条件及体系 | 第46页 |
| ·体系中L-丝氨酸的检测-DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析法 | 第46页 |
| ·高效液相色谱HPLC检测体系中L-丝氨酸的含量 | 第46页 |
| ·利用酶促转化法生产L-丝氨酸 | 第46-50页 |
| ·菌株的选择及工程菌的构建 | 第46-47页 |
| ·THFA的化学合成 | 第47页 |
| ·测定两种工程菌的生物量 | 第47页 |
| ·酶促转化法生产L-丝氨酸的条件及体系 | 第47-48页 |
| ·高效液相色谱HPLC检测体系中L-丝氨酸的含量 | 第48-50页 |
| ·两种工程菌SaSHMT和EcSHMT生产能力的对比 | 第50-51页 |
| ·AnglyA的定点突变 | 第51-54页 |
| ·序列比对分析及模拟三维结构确定突变位点 | 第51-52页 |
| ·引物设计 | 第52-53页 |
| ·定点突变及检测 | 第53-54页 |
| ·突变子酶学性质及动力学的检测 | 第54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-74页 |
| ·Shewanella algae中glyA基因序列的获得 | 第54-58页 |
| ·SaglyA保守区域序列 | 第54-55页 |
| ·保守区域两端序列 | 第55页 |
| ·SaglyA全长序列 | 第55-56页 |
| ·SaglyA和SaSHMT的序列分析 | 第56-57页 |
| ·SaSHMT与不同物种SHMT的进化关系分析 | 第57-58页 |
| ·Arthrobacter nicotianae中glyA基因的克隆 | 第58-60页 |
| ·两端简并引物的设计及A.nicotianae glyA基因的扩增 | 第58页 |
| ·TA克隆及获得A.nicotianae glyA基因的完整序列 | 第58-59页 |
| ·AnglyA和AnSHMT的序列分析 | 第59-60页 |
| ·AnSHMT与不同物种SHMT的进化关系分析 | 第60页 |
| ·两种细菌SHMT的异源表达及纯化 | 第60-62页 |
| ·构建蛋白表达系统 | 第60-61页 |
| ·蛋白表达、纯化及SDS-PAGE电泳分析 | 第61-62页 |
| ·SHMT酶学性质测定 | 第62-69页 |
| ·苯甲醛标准曲线的绘制 | 第62页 |
| ·SaSHMT的酶学性质 | 第62-65页 |
| ·AnSHMT的酶学性质及其与I249L-SHMT酶学性质的比较 | 第65-69页 |
| ·运用静息细胞方法生产L-丝氨酸 | 第69-70页 |
| ·利用酶促转化法生产L-丝氨酸 | 第70-73页 |
| ·测定两种工程菌的生物量 | 第70页 |
| ·酶促转化法生产L-丝氨酸及HPLC检测体系中L-丝氨酸的产量 | 第70-73页 |
| ·AnSHMT的定点突变 | 第73-74页 |
| ·定点突变及结果检测 | 第73-74页 |
| ·突变子的酶学性质分析 | 第74页 |
| 4 结果与讨论 | 第74-78页 |
| ·glyA基因序列的获得 | 第74-75页 |
| ·SHMTs的酶学性质分析 | 第75页 |
| ·工程菌pET-15b-SaSHMT和pET-15b-EcSHMT表达及酶活力比较 | 第75页 |
| ·工程菌pET-15b-SaSHMT产酸能力分析及其与pET-15b-EcSHMT生产能力的比较 | 第75-76页 |
| ·AnSHMT定点突变的讨论 | 第76-77页 |
| ·工作展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 研究成果 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
