| 目录 | 第1-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-48页 |
| 1 β-葡聚糖酶的研究概况 | 第17-21页 |
| ·β-葡聚糖酶的分布 | 第17页 |
| ·β-葡聚糖酶的酶学性质 | 第17-18页 |
| ·β-葡聚糖酶的结构与功能研究 | 第18-19页 |
| ·β-葡聚糖酶的三级结构和折叠 | 第18页 |
| ·β-葡聚糖酶催化水解机理和催化氨基酸残基 | 第18-19页 |
| ·β-葡聚糖酶的分子生物学研究 | 第19-20页 |
| ·β-葡聚糖酶的蛋白质工程 | 第20-21页 |
| ·杂合酶和热稳定性 | 第20页 |
| ·循环重排 | 第20-21页 |
| 2 体外分子定向进化研究进展 | 第21-36页 |
| ·体外分子定向进化的基本思路和策略 | 第21页 |
| ·体外分子定向进化技术的演变和发展 | 第21-30页 |
| ·以寡核苷酸为基础的最大随机化过程 | 第21-23页 |
| ·整个基因的随机突变 | 第23页 |
| ·依赖于序列同源的重组 | 第23-28页 |
| ·不依赖于序列同源的重组 | 第28-30页 |
| ·用计算机数值模拟进行定向进化 | 第30页 |
| ·蛋白质进化方法的优、缺点 | 第30-33页 |
| ·突变体文库筛选技术 | 第33-34页 |
| ·体外分子定向进化的应用和发展前景 | 第34-36页 |
| 3 嗜热酶的研究进展 | 第36-46页 |
| ·嗜热酶的生物化学和分子生物学特性 | 第36-37页 |
| ·嗜热酶基因的克隆与表达 | 第37页 |
| ·蛋白质的热稳定性机制 | 第37-42页 |
| ·氨基酸组成及其内在倾向性对蛋白质热稳定性的影响 | 第38-39页 |
| ·蛋白质分子内作用力对蛋白质热稳定性的影响 | 第39-40页 |
| ·蛋白质构型对蛋白质热稳定性的影响 | 第40-42页 |
| ·提高蛋白质稳定性的策略 | 第42-46页 |
| ·蛋白质工程策略 | 第42-44页 |
| ·计算机数值模拟方法 | 第44页 |
| ·化学修饰法 | 第44-45页 |
| ·保护剂的添加 | 第45-46页 |
| 4 选题背景及研究内容 | 第46-48页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 B-葡聚糖酶基因的克隆与表达 | 第48-69页 |
| 0 前言 | 第48页 |
| 1 材料与方法 | 第48-58页 |
| ·菌株、质粒和酶 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48-49页 |
| ·主要仪器和设备 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-58页 |
| ·引物的设计和合成 | 第49-50页 |
| ·基因组提取 | 第50页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的扩增 | 第50页 |
| ·PCR产物的纯化和回收 | 第50页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第50页 |
| ·感受态细胞的制备和转化 | 第50-51页 |
| ·质粒提取 | 第51-52页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第52-53页 |
| ·平衡酚的制备 | 第53页 |
| ·双酶切大片断的低熔点胶回收 | 第53-54页 |
| ·重组质粒pUCmT-bgls的筛选和鉴定 | 第54页 |
| ·重组质粒pET28 a(+)-bgls的构建 | 第54页 |
| ·表达载体pET28(+)-bgls的筛选和鉴定 | 第54-55页 |
| ·表达产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第55-56页 |
| ·β葡聚糖酶基因的诱导表达 | 第56页 |
| ·胞外、胞内和周质空间的β葡聚糖酶的提取 | 第56-57页 |
| ·β-葡聚糖酶的酶活测定 | 第57页 |
| ·β-葡聚糖酶的纯化 | 第57-58页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第58页 |
| ·β-葡聚糖酶的最适反应温度 | 第58页 |
| ·β-葡聚糖酶的热稳定性 | 第58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-68页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的扩增 | 第58-59页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的克隆与鉴定 | 第59-61页 |
| ·阳性重组质粒pUCmT-bgls的PCR鉴定 | 第59页 |
| ·阳性重组质粒pUCmT-bgls的双酶切鉴定 | 第59页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的序列测定 | 第59-61页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·表达载体和宿主的选择 | 第61页 |
| ·重组表达载体pET28a(+)-bgls的构建思路 | 第61-62页 |
| ·重组表达载体pET28a(+)-bgls的PCR鉴定 | 第62-63页 |
| ·重组表达载体pET28a(+)-bgls的双酶切鉴定 | 第63页 |
| ·重组表达载体pET28a(+)-bgls中目的序列的测定 | 第63页 |
| ·重组表达载体pET28a(+)-bgls的诱导表达 | 第63-64页 |
| ·胞外、胞内和周质空间的β-葡聚糖酶分布 | 第64-66页 |
| ·β-葡聚糖酶的纯化 | 第66页 |
| ·β-葡聚糖酶的热学性质 | 第66-68页 |
| 3 讨论 | 第68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第三章 高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶方法 | 第69-80页 |
| 0 前言 | 第69页 |
| 1 材料和方法 | 第69-71页 |
| ·菌株、试剂 | 第69-70页 |
| ·培养基和鉴定平板 | 第70页 |
| ·主要仪器和设备 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-71页 |
| ·IPTG用量和加入方式对平板上的菌落生长和β-葡聚糖酶表达的影响 | 第70页 |
| ·平板上的菌落密度对筛选的影响 | 第70页 |
| ·细菌培养时间对筛选的影响 | 第70-71页 |
| ·定位膜转印 | 第71页 |
| ·筛选平板的制作和显色反应 | 第71页 |
| ·β-葡聚糖酶酶活测定 | 第71页 |
| 2 结果 | 第71-78页 |
| ·IPTG用量对平板上菌落生长和β-葡聚糖酶表达的影响 | 第71-72页 |
| ·细菌培养时间对筛选的影响 | 第72-73页 |
| ·菌落密度对筛选的影响 | 第73-75页 |
| ·膜片处理温度对筛选的影响 | 第75-76页 |
| ·耐高温β-葡聚糖酶菌株筛选方法的建立 | 第76页 |
| ·以滤膜为基础的高通量筛选方法的稳定性考察 | 第76-78页 |
| ·以滤膜为基础的高通量筛选方法与其它平板筛选方法的比较 | 第78页 |
| 3 讨论 | 第78-79页 |
| 4 结论 | 第79-80页 |
| 第四章 热稳定性β-葡聚糖酶的定向进化 | 第80-106页 |
| 0 前言 | 第80页 |
| 1 材料与方法 | 第80-88页 |
| ·实验材料 | 第80-81页 |
| ·培养基 | 第81页 |
| ·主要仪器和设备 | 第81页 |
| ·实验方法 | 第81-88页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第81页 |
| ·易错PCR扩增β-葡聚糖酶基因 | 第81-82页 |
| ·随机突变酶的突变 | 第82页 |
| ·DNA改组(DNA shuffling) | 第82-84页 |
| ·DEAE-纤维素膜电泳回收DNA小片段 | 第84-85页 |
| ·回收双酶切的质粒载体 | 第85-86页 |
| ·突变库的构建 | 第86页 |
| ·含突变基因的表达文库的构建 | 第86页 |
| ·突变文库的筛选 | 第86-87页 |
| ·β-葡聚糖酶的纯化 | 第87页 |
| ·β-葡聚糖酶活力测定 | 第87页 |
| ·蛋白质的SDS-PAGE电泳 | 第87页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第87页 |
| ·DNA测序和序列比对 | 第87页 |
| ·野生型酶和突变酶的催化动力学研究 | 第87-88页 |
| ·野生型酶和突变酶的热稳定性 | 第88页 |
| ·野生型酶和突变酶的最适反应温度 | 第88页 |
| ·野生型酶和突变酶的最适pH值 | 第88页 |
| ·野生型酶和突变酶的pH值稳定性 | 第88页 |
| ·碱基和氨基酸序列比较分析 | 第88页 |
| 2 结果和分析 | 第88-103页 |
| ·β-葡聚糖酶体外定向进化实验设计 | 第88-89页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的易错PCR | 第89-94页 |
| ·易错PCR条件的确定 | 第89-93页 |
| ·突变文库中突变子产生透明圈的情况 | 第93-94页 |
| ·随机突变文库的构建和筛选 | 第94页 |
| ·热稳定性突变体的测序 | 第94页 |
| ·第一代突变体基因的DNA改组 | 第94-100页 |
| ·DNA改组的设计思路 | 第94-96页 |
| ·DNA改组文库的构建 | 第96-100页 |
| ·热稳定性酶的耐热机制分析 | 第100页 |
| ·突变酶和野生酶的纯化鉴定 | 第100-101页 |
| ·野生酶和突变酶的酶学性质 | 第101-103页 |
| ·野生酶和突变酶的催化动力学 | 第101页 |
| ·野生酶和突变酶的热稳定性和最适反应温度 | 第101-102页 |
| ·野生酶和突变酶的最适pH值和pH值稳定性 | 第102-103页 |
| 3 讨论 | 第103-104页 |
| 4 结论 | 第104-106页 |
| 第五章 突变株EGS1和EGS2的遗传稳定性 | 第106-111页 |
| 0 前言 | 第106页 |
| 1 材料与方法 | 第106-107页 |
| ·菌株、质粒、酶及试剂 | 第106页 |
| ·培养基 | 第106页 |
| ·主要仪器和设备 | 第106-107页 |
| 1..4 实验方法 | 第107页 |
| ·菌种传代方法 | 第107页 |
| ·质粒对宿主的传代稳定性 | 第107页 |
| ·β-葡聚糖酶活性测定 | 第107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-109页 |
| ·质粒稳定性测定 | 第107-108页 |
| ·EGs1突变株的质粒稳定性测定 | 第107-108页 |
| ·EGs2突变株的质粒稳定性测定 | 第108页 |
| ·突变株各代细胞表达目的产物的稳定性 | 第108-109页 |
| ·EGs1突变株的表达稳定性 | 第109页 |
| ·EGs2突变株的表达稳定性 | 第109页 |
| 3 讨论 | 第109-110页 |
| 4 结论 | 第110-111页 |
| 第六章 热稳定性突变体EGS2的发酵工艺研究 | 第111-125页 |
| 0 前言 | 第111页 |
| 1 材料与方法 | 第111-112页 |
| ·试剂、材料 | 第111页 |
| ·主要仪器和设备 | 第111页 |
| ·实验方法 | 第111-112页 |
| ·菌种活化 | 第112页 |
| ·装液量、接种量和初始pH值的优化 | 第112页 |
| ·IPTG对目的产物表达的影响 | 第112页 |
| ·乳糖对目的产物表达的影响 | 第112页 |
| ·诱导温度对目的产物表达的影响 | 第112页 |
| ·菌株EGs2的生物量测定 | 第112页 |
| 2 结果与分析 | 第112-123页 |
| ·最佳装液量、接种量和初始pH的确定 | 第112-116页 |
| ·目的产物表达和菌体生长的条件优化 | 第116-123页 |
| ·IPTG和乳糖浓度对菌体生长和目的产物表达的影响 | 第116-118页 |
| ·诱导时间对菌体生长和目的产物表达的影响 | 第118-120页 |
| ·诱导温度对菌体生长和目的产物表达的影响 | 第120-123页 |
| 3 讨论 | 第123-124页 |
| 4 结论 | 第124-125页 |
| 第七章 保护剂对β-葡聚糖酶稳定性影响的研究 | 第125-132页 |
| 0 前言 | 第125页 |
| 1 实验材料、仪器和方法 | 第125-126页 |
| ·实验材料 | 第125页 |
| ·主要仪器和设备 | 第125-126页 |
| ·实验方法 | 第126页 |
| ·β-葡聚糖酶活力测定 | 第126页 |
| ·保护剂的筛选 | 第126页 |
| ·β-葡聚糖酶的热稳定性实验 | 第126页 |
| ·β-葡聚糖酶的加速实验 | 第126页 |
| 2 结果与分析 | 第126-131页 |
| ·不同物质对β-葡聚糖酶热稳定性的影响 | 第126-127页 |
| ·保护剂浓度对β-葡聚糖酶热稳定性的影响 | 第127-129页 |
| ·复合保护剂配方的优化 | 第129-130页 |
| ·复合保护剂对β-葡聚糖酶热稳定性的影响 | 第130页 |
| ·复合保护剂对β-葡聚糖酶储存稳定性的影响 | 第130-131页 |
| 3 讨论 | 第131页 |
| 4 结论 | 第131-132页 |
| 第八章 β-葡聚糖酶的储存寿命估算 | 第132-138页 |
| 0 前言 | 第132页 |
| 1 材料和方法 | 第132-133页 |
| ·实验材料 | 第132页 |
| ·主要仪器和设备 | 第132-133页 |
| ·实验方法 | 第133页 |
| ·β-葡聚糖酶活力测定 | 第133页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第133页 |
| ·β-葡聚糖酶的加速实验 | 第133页 |
| ·实验数据的处理 | 第133页 |
| 2 结果与分析 | 第133-136页 |
| ·β-葡聚糖酶加速稳定性实验测定结果 | 第133-134页 |
| ·β-葡聚糖酶在28℃、36.2℃和45℃下的热降解速度 | 第134页 |
| ·β-葡聚糖酶在不同温度下的热降解速度 | 第134-135页 |
| ·β-葡聚糖酶储存寿命的估算 | 第135-136页 |
| 3 讨论 | 第136-137页 |
| 4 结论 | 第137-138页 |
| 第九章 结论与后续研究展望 | 第138-140页 |
| 1 结论 | 第138-139页 |
| 2 后续研究展望 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-162页 |
| 致谢 | 第162-163页 |
| 附：个人简历及攻读博士学位期间发表的论文 | 第163页 |
