| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶背景 | 第13页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶概况 | 第13-17页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶的来源及性质 | 第13-14页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶的结构 | 第14-16页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶的用途 | 第16-17页 |
| ·对精氨酸脱亚胺酶敏感的癌细胞类型 | 第17-19页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶的克隆与表达 | 第19页 |
| ·国内外致力于精氨酸脱亚胺酶研究的主要机构及研究进展 | 第19-24页 |
| ·本论文的研究意义和主要研究内容 | 第24-27页 |
| ·本课题研究意义 | 第24-25页 |
| ·课题来源 | 第25页 |
| ·本课题研究基础及本论文研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 产精氨酸脱亚胺酶菌种的筛选和鉴定 | 第27-39页 |
| ·前言 | 第27页 |
| ·实验材料 | 第27-28页 |
| ·菌株 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27-28页 |
| ·主要设备 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-31页 |
| ·常用试剂配制 | 第28页 |
| ·菌体培养 | 第28-29页 |
| ·ADI酶活测定 | 第29页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶产生菌的筛选 | 第29-30页 |
| ·形态及生理生化特性 | 第30-31页 |
| ·16s rRNA基因序列分析 | 第31页 |
| ·结果与讨论 | 第31-38页 |
| ·瓜氨酸测定标准曲线 | 第31-32页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶产生菌的筛选 | 第32-33页 |
| ·菌株SWP1的形态特征 | 第33-34页 |
| ·菌株SWP1的生理生化特征 | 第34-36页 |
| ·16s rRNA基因序列分析 | 第36-38页 |
| ·本章小结 | 第38-39页 |
| 第三章 变形假单胞菌CGMCC2039发酵条件优化 | 第39-49页 |
| ·前言 | 第39页 |
| ·实验材料 | 第39-40页 |
| ·菌株 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·主要设备 | 第39-40页 |
| ·实验方法 | 第40-41页 |
| ·常用试剂配制 | 第40页 |
| ·培养方法 | 第40页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶酶活测定 | 第40页 |
| ·精氨酸浓度测定 | 第40页 |
| ·水杨酸-次氯酸盐光度法测氨氮 | 第40页 |
| ·细胞干重 | 第40页 |
| ·底物诱导对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第40页 |
| ·碳源对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第40页 |
| ·碳源比例的确定 | 第40-41页 |
| ·氮源对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第41页 |
| ·初始pH对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第41页 |
| ·装液量对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第41页 |
| ·接种量对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第41页 |
| ·实验结果 | 第41-47页 |
| ·底物诱导对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第41-42页 |
| ·营养条件对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第42-45页 |
| ·环境条件对变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力的影响 | 第45-46页 |
| ·变形假单胞菌CGMCC2039菌体生长和产酶能力发酵曲线 | 第46-47页 |
| ·本章小结 | 第47-49页 |
| 第四章 精氨酸脱亚胺酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达 | 第49-68页 |
| ·前言 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49-51页 |
| ·菌株和质粒 | 第49-51页 |
| ·主要试剂 | 第51页 |
| ·培养基 | 第51页 |
| ·主要设备 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-58页 |
| ·常用试剂配制 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)ADI基因 | 第52-53页 |
| ·变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)ADI基因的克隆 | 第53-54页 |
| ·基因序列的测定及同源性分析 | 第54页 |
| ·变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)ADI基因的表达 | 第54-57页 |
| ·重组质粒pET2a4-ADI的构建 | 第54-55页 |
| ·重组T载体与表达载体双酶切 | 第55-56页 |
| ·ADI基因与表达载体酶切产物的连接 | 第56页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌BLZID(E)3 | 第56页 |
| ·菌落PCR验证 | 第56-57页 |
| ·重组质粒pET42a一ADI的双酶切鉴定 | 第57页 |
| ·表达产物的SDS一APCE电泳分析 | 第57页 |
| ·表达产物的活性分析 | 第57页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶基因的优化表达 | 第57-58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-67页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶基因的PCR扩增 | 第58页 |
| ·ADI基因的克隆 | 第58-59页 |
| ·基因序列的测定及同源性分析 | 第59-61页 |
| ·ADI基因的表达 | 第61-63页 |
| ·重组子的诱导表达及其条件的初步优化 | 第63-67页 |
| ·本章小结 | 第67-68页 |
| 第五章 重组精氨酸脱亚胺酶的纯化及酶学性质研究 | 第68-79页 |
| ·前言 | 第68页 |
| ·实验材料 | 第68-69页 |
| ·菌株 | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68页 |
| ·培养基 | 第68-69页 |
| ·主要设备 | 第69页 |
| ·实验方法 | 第69-71页 |
| ·常用试剂 | 第69页 |
| ·菌体培养 | 第69页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第69页 |
| ·超声波破碎 | 第69-70页 |
| ·HiPrep DEAE FF层析 | 第70页 |
| ·Superdex~(TM) 200凝胶过滤 | 第70页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第70页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)最适反应温度 | 第70页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)最适反应pH | 第70页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)热稳定性的研究 | 第70页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶米氏常数K_m的测定 | 第70页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶底物特异性分析 | 第70-71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-78页 |
| ·蛋白质含量标准曲线 | 第71页 |
| ·超声波破碎 | 第71-72页 |
| ·HiPrep DEAE FF层析 | 第72页 |
| ·Superdex~(TM) 200凝胶过滤 | 第72-73页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第73-74页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶最适反应温度 | 第74页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶最适反应pH | 第74-75页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶热稳定性的研究 | 第75页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶米氏常数K_m的测定 | 第75-76页 |
| ·重组精氨酸脱亚胺酶底物特异性分析 | 第76-78页 |
| ·本章小结 | 第78-79页 |
| 第六章 精氨酸脱亚胺酶的定向改造 | 第79-95页 |
| ·前言 | 第79页 |
| ·实验材料 | 第79-80页 |
| ·菌株和质粒 | 第79页 |
| ·主要试剂 | 第79-80页 |
| ·培养基 | 第80页 |
| ·主要设备 | 第80页 |
| ·实验方法 | 第80-83页 |
| ·常用试剂配制 | 第80页 |
| ·大肠杆菌质粒提取 | 第80-81页 |
| ·易错PCR扩增精氨酸脱亚胺酶基因 | 第81页 |
| ·含变库基因的质粒文库构建 | 第81-82页 |
| ·含突变基因的表达文库构建 | 第82页 |
| ·突变文库的筛选 | 第82-83页 |
| ·突变精氨酸脱亚胺酶的纯化 | 第83页 |
| ·突变精氨酸脱亚胺酶的酶活测定 | 第83页 |
| ·突变精氨酸脱亚胺酶的酶学性质 | 第83页 |
| ·DNA测序和序列比对 | 第83页 |
| ·结果与讨论 | 第83-94页 |
| ·精氨酸脱亚胺酶体外定向进化实验设计 | 第83-84页 |
| ·易错PCR扩增ADI基因 | 第84页 |
| ·构建基因突变库 | 第84-85页 |
| ·高通量筛选方法构建 | 第85-87页 |
| ·突变体314精氨酸脱亚胺酶的纯化 | 第87-89页 |
| ·突变菌株314与出发菌株精氨酸脱亚胺酶性质比较 | 第89页 |
| ·突变酶突变位点序列分析 | 第89-91页 |
| ·突变酶蛋白结构模拟 | 第91-94页 |
| ·本章小结 | 第94-95页 |
| 主要结论 | 第95-97页 |
| 论文创新点 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-106页 |
| 附录:博士在读期间已发表(含待发表)论文 | 第106页 |
