| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 绪论 | 第9-17页 |
| 1.1 囊泡运输简介 | 第9-10页 |
| 1.2 SNARE蛋白研究现状 | 第10-14页 |
| 1.2.1 SNARE蛋白分类 | 第10页 |
| 1.2.2 SNARE核心复合体结构及其介导的膜融合过程 | 第10-12页 |
| 1.2.2.1 Syntaxin | 第11-12页 |
| 1.2.2.2 SNAP25类蛋白 | 第12页 |
| 1.2.2.3 VAMPs | 第12页 |
| 1.2.2.4 膜融合过程 | 第12页 |
| 1.2.3 SNARE蛋白在储藏蛋白质运输中的分工 | 第12-14页 |
| 1.2.4 SNARE蛋白的生理学意义 | 第14页 |
| 1.3 囊泡运输过程中SNARE蛋白的相互作用因子 | 第14-16页 |
| 1.3.1 SM (Sec1/Munc18)蛋白 | 第15页 |
| 1.3.2 Tethering factor/complex | 第15-16页 |
| 1.4 研究目的及意义 | 第16-17页 |
| 2 实验材料和方法 | 第17-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第17页 |
| 2.2 主要实验仪器 | 第17页 |
| 2.3 试剂 | 第17页 |
| 2.4 载体和菌株 | 第17-18页 |
| 2.5 纯和突变体筛选 | 第18-19页 |
| 2.5.1 突变体纯合体的筛选原理 | 第18页 |
| 2.5.2 突变体播种及采样 | 第18页 |
| 2.5.3 叶片基因组DNA的提取 | 第18页 |
| 2.5.4 突变体纯和性PCR扩增检测 | 第18-19页 |
| 2.5.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第19页 |
| 2.6 转基因植物的制作 | 第19-27页 |
| 2.6.1 质粒的构建 | 第20-24页 |
| 2.6.1.1 模板的制备 | 第20-21页 |
| 2.6.1.2 PCR扩增获得目的片段 | 第21页 |
| 2.6.1.3 琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收 | 第21-22页 |
| 2.6.1.4 连接TOPO载体 | 第22页 |
| 2.6.1.5 大肠杆菌转化 | 第22-23页 |
| 2.6.1.6 菌落PCR鉴定阳性重组子 | 第23页 |
| 2.6.1.7 质粒提取 | 第23-24页 |
| 2.6.1.8 LR反应连接终载体 | 第24页 |
| 2.6.1.9 LR反应产物的热激转化 | 第24页 |
| 2.6.1.10 菌落PCR鉴定阳性重组 | 第24页 |
| 2.6.1.11 质粒提取 | 第24页 |
| 2.6.2 农杆菌转化 | 第24-25页 |
| 2.6.2.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 2.6.2.2 热激转化法转化根癌农杆菌 | 第25页 |
| 2.6.2.3 农杆菌菌落PCR鉴定 | 第25页 |
| 2.6.3 农杆菌侵染 | 第25-26页 |
| 2.6.4 转基因植株纯合体的筛选 | 第26页 |
| 2.6.5 半定量PCR检测目的基因的表达情况 | 第26-27页 |
| 2.6.5.1 RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.6.5.2 cDNA第一链的合成 | 第27页 |
| 2.6.5.3 半定量PCR(RT-PCR) | 第27页 |
| 2.7 酵母双杂交 | 第27-32页 |
| 2.7.1 酵母双杂交质粒构建 | 第28-30页 |
| 2.7.1.1 蛋白结构域顶测 | 第28-29页 |
| 2.7.1.2 质粒构建 | 第29-30页 |
| 2.7.2 实验试剂准备 | 第30-31页 |
| 2.7.3 AH109酵母菌株复苏 | 第31页 |
| 2.7.4 酵母菌感受态制备及待测质粒转化 | 第31页 |
| 2.7.5 相互作用质粒的鉴定 | 第31-32页 |
| 2.8 pull-down分析 | 第32-36页 |
| 2.8.1 实验材料培养 | 第32页 |
| 2.8.2 试剂准备 | 第32页 |
| 2.8.3 植物组织的裂解 | 第32页 |
| 2.8.4 目标蛋白的磁性标记及分离 | 第32-33页 |
| 2.8.5 western检测 | 第33-36页 |
| 2.8.5.1 试剂配制 | 第34-35页 |
| 2.8.5.2 SDS-PAGE | 第35页 |
| 2.8.5.3 转膜 | 第35页 |
| 2.8.5.4 孵育一抗 | 第35页 |
| 2.8.5.5 孵育二抗 | 第35-36页 |
| 2.8.5.6 显影 | 第36页 |
| 2.9 瞬时表达 | 第36-39页 |
| 2.9.1 质粒构建及提取 | 第36页 |
| 2.9.2 瞬时表达操作 | 第36-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-49页 |
| 3.1 atsyp331突变体筛选 | 第39-40页 |
| 3.2 AtSYP332 RNAi转基因植株的制作及纯合体筛选 | 第40-41页 |
| 3.3 atsyp331突变体及AtSYP332 RNAi转基因植物中目的基因RT-PCR及表型观察 | 第41-43页 |
| 3.3.1 半定量PCR(RT-PCR)检测目的基因的表达情况 | 第41-42页 |
| 3.3.2 表型观察 | 第42-43页 |
| 3.4 酵母双杂交 | 第43-46页 |
| 3.4.1 质粒构建 | 第43-45页 |
| 3.4.2 酵母双杂交实验结果及分析 | 第45-46页 |
| 3.5 pull-down分析发掘潜在互作因子 | 第46-47页 |
| 3.5.1 质粒构建及过表达转基因植株的制备 | 第46页 |
| 3.5.2 pull-down实验 | 第46页 |
| 3.5.3 Western分析 | 第46-47页 |
| 3.6 瞬时表达 | 第47-49页 |
| 结论 | 第49-50页 |
| 讨论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
