| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 中英文缩写词表 | 第7-11页 |
| 前言 | 第11-13页 |
| 一 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 胰蛋白酶原和胰蛋白酶 | 第13-15页 |
| ·胰蛋白酶原的活化及胰蛋白酶的作用机制 | 第13-15页 |
| ·胰蛋白酶的酶学特性研究 | 第15页 |
| 2 胰蛋白酶的功能与用途 | 第15-18页 |
| ·胰蛋白酶在畜牧业的应用 | 第15-16页 |
| ·胰蛋白酶在现代分子生物学的应用 | 第16-17页 |
| ·胰蛋白酶在医药方面的应用 | 第17页 |
| ·胰蛋白酶在食品加工中的应用 | 第17-18页 |
| 3 胰蛋白酶(原)分子生物学与基因工程 | 第18-21页 |
| ·胰蛋白酶(原)基因及其克隆 | 第18-20页 |
| ·真菌胰蛋白酶(原)基因 | 第18页 |
| ·无脊椎动物胰蛋白酶(原)基因 | 第18-19页 |
| ·脊椎动物胰蛋白酶(原)基因 | 第19-20页 |
| ·胰蛋白酶(原)基因工程 | 第20页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的应用 | 第20-21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的优越性 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母启动外源基因的表达机制及菌株与表型 | 第21页 |
| 4 胰蛋白酶的应用前景和面临的问题 | 第21-23页 |
| 二 本研究的目的,内容,意义与技术路线 | 第23-25页 |
| 1 研究目的 | 第23页 |
| 2 研究内容 | 第23页 |
| 3 研究的意义 | 第23页 |
| 4 研究技术路线 | 第23-25页 |
| 三 材料与方法 | 第25-38页 |
| 1.材料和仪器 | 第25-27页 |
| ·材料与试剂 | 第25页 |
| ·试剂 | 第25页 |
| ·主要培养基 | 第25-26页 |
| ·主要溶液 | 第26-27页 |
| ·主要仪器设备 | 第27页 |
| ·引物设计与合成 | 第27页 |
| 2. 实验方法 | 第27-38页 |
| ·PPT基因的克隆 | 第27-31页 |
| ·胰腺组织总RNA的提取 | 第28页 |
| ·基因的扩增 | 第28-31页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-proELA2表达载体的构建 | 第31-33页 |
| ·含Not Ⅰ和Xba Ⅰ限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第31页 |
| ·PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接 | 第31-32页 |
| ·感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选 | 第32-33页 |
| ·重组PPT的酵母转化与表达 | 第33-38页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-PPT的线性化 | 第33-34页 |
| ·pPICZαA-PPT重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选 | 第34-36页 |
| ·重组猪PPT酶原的诱导表达 | 第36页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第36-38页 |
| 四 实验结果与分析 | 第38-46页 |
| 1 PPT基因TA克隆与序列分析 | 第38-41页 |
| ·总RNA的提取与PPT编码区RT-PCR扩增 | 第38页 |
| ·PPT基因TA克隆 | 第38-39页 |
| ·PMD18-T-PPT酶切鉴定及测序 | 第39页 |
| ·PPT基因序列分析 | 第39-41页 |
| ·PPT核苷酸及推导氨基酸序列分析 | 第40页 |
| ·PPT基因序列比对分析 | 第40-41页 |
| 2 pPICZαA-PPT重组表达质粒的构建及鉴定 | 第41-43页 |
| ·含酶切位点PPT基因片段的扩增结果 | 第41-42页 |
| ·pPICZαA质粒的双酶切 | 第42页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 3 P.pastoris/pPICZαA-PPT表达菌株的转化与筛选 | 第43-45页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第43-44页 |
| ·PCR检测转化子 | 第44页 |
| ·Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测 | 第44-45页 |
| 4 PPT在P.pastoris中的表达、纯化 | 第45-46页 |
| 五 讨论 | 第46-50页 |
| 1 PPT基因的克隆 | 第46页 |
| ·引物设计 | 第46页 |
| ·PPT cDNA及推导氨基酸的分析 | 第46页 |
| 2 PPT在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第46-48页 |
| 3 PPT的纯化 | 第48-50页 |
| 六 结论与展望 | 第50-53页 |
| 1 结论 | 第50页 |
| 2 展望 | 第50-53页 |
| ·PPT的激活与活性检测 | 第50-51页 |
| ·优化PPT工程菌的发酵工艺研究 | 第51页 |
| ·改造PPT的分子结构提高其活性和稳定性 | 第51页 |
| ·PPT在动物生产中的应用 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 附录一 | 第61-62页 |
| 附录二 | 第62-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
