| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 前言 | 第18-30页 |
| 第一章 报告基因及治疗基因的选择和质粒的抽提 | 第30-37页 |
| 1 试剂和仪器 | 第30-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-33页 |
| 2.1 培养基的配制 | 第31页 |
| 2.2 细菌的复苏、扩增和冻存 | 第31页 |
| 2.3 质粒DNA的大量抽提 | 第31-32页 |
| 2.4 DNA浓度和纯度的测定 | 第32-33页 |
| 3 实验结果 | 第33-36页 |
| 3.1 绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2质粒的提取 | 第33页 |
| 3.2 虫荧光素酶报告基因pGL3-promoter质粒的提取 | 第33-34页 |
| 3.3 治疗基因质粒pRNAT的提取 | 第34-36页 |
| 4 本章小结 | 第36页 |
| 参考文献 | 第36-37页 |
| 第二章 Pluronic-PPI共聚物的合成和MCS的制备及性质考察 | 第37-61页 |
| 2-1 Pluronic-PPI的合成及表征 | 第37-46页 |
| 1 试剂和仪器 | 第37-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-41页 |
| 2.1 不同修饰度Pluronic-PPI的合成 | 第38-40页 |
| 2.1.1 非单端保护的接枝反应 | 第38-39页 |
| 2.1.2 单端保护的接枝反应 | 第39-40页 |
| 2.2 Plu-PPI的分离纯化 | 第40页 |
| 2.3 Plu-PPI的分子量及修饰度测定 | 第40页 |
| 2.3.1 元素分析 | 第40页 |
| 2.3.2 H-NMR图谱 | 第40页 |
| 2.3.3 凝胶渗透色谱 | 第40页 |
| 2.4 MTT法测定Plu-PPI的细胞毒性 | 第40-41页 |
| 3 实验结果 | 第41-45页 |
| 3.1 不同修饰度Plu-PPI的合成 | 第41-45页 |
| 3.1.1 元素分析 | 第41页 |
| 3.1.2 H-NMR图谱 | 第41-43页 |
| 3.1.3 凝胶渗透色谱 | 第43-44页 |
| 3.1.4 MTT法测定材料的细胞毒性 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-46页 |
| 4.1 F127和PPI接枝不成功 | 第45页 |
| 4.2 单端保护的接枝反应与非单端保护的接枝反应 | 第45-46页 |
| 4.3 由元素分析结果计算的分子量和GPC法得到的分子量结果相差很大 | 第46页 |
| 4.4 L61修饰PPI没有降低PPI的细胞毒性 | 第46页 |
| 2-2 混合共聚物载体系统制备方法的研究 | 第46-51页 |
| 1 试剂和仪器 | 第46页 |
| 2 实验方法 | 第46-47页 |
| 2.1 MCS复合物处方组成 | 第46-47页 |
| 2.2 制备体系、混合方式对粒径的影响 | 第47页 |
| 2.3 Zeta电位测定 | 第47页 |
| 2.4 复合物制备 | 第47页 |
| 2.5 稳定性考察(粒径随时间的变化) | 第47页 |
| 3 实验结果 | 第47-50页 |
| 3.1 制备体系对粒径和电位影响 | 第48页 |
| 3.2 混合方式对粒径的影响 | 第48-49页 |
| 3.3 复合物的粒径和zeta电位表征 | 第49-50页 |
| 3.3.1 P123-2.5g-PPI和PPI压缩质粒DNA形成复合物的粒径比较 | 第49页 |
| 3.3.2 MCS复合物的粒径和电位表征 | 第49-50页 |
| 3.4 复合物粒径随时间的变化 | 第50页 |
| 4 讨论 | 第50-51页 |
| 4.1 制备体系对粒径和zeta电位的影响 | 第50-51页 |
| 4.2 制备体系对稳定性的影响 | 第51页 |
| 4.3 混合条件对粒径的影响 | 第51页 |
| 2-3 混合共聚物载体系统的体外性质考察 | 第51-58页 |
| 1 试剂和仪器 | 第51-52页 |
| 2 实验方法 | 第52-53页 |
| 2.1 PPI/DNA和Plu-PPI/DNA复合物的制备 | 第52页 |
| 2.2 0.7%琼脂糖凝胶电泳阻滞分析 | 第52页 |
| 2.3 DNaseⅠ酶切保护实验 | 第52页 |
| 2.4 抗肝素钠解离作用 | 第52页 |
| 2.4.1 不同浓度肝素钠对复合物的解离作用 | 第52页 |
| 2.4.2 复合物抗肝素钠解离作用 | 第52页 |
| 2.5 抗血清解离作用 | 第52-53页 |
| 3 实验结果 | 第53-56页 |
| 3.1 凝胶电泳阻滞分析 | 第53页 |
| 3.2 DNaseⅠ酶切保护实验 | 第53-55页 |
| 3.2.1 MCS抵抗不同量DNaseⅠ的降解作用 | 第53-54页 |
| 3.2.2 游离P123对MCS复合物酶切保护作用的影响 | 第54-55页 |
| 3.3 复合物抗血清解离作用 | 第55页 |
| 3.4 复合物抗肝素钠解离作用 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 4.1 MCS能够一定程度上对抗肝素钠的解离作用 | 第56-57页 |
| 4.2 MCS对质粒DNA的酶切保护作用 | 第57页 |
| 4.3 MCS能够抵抗血清的解离作用 | 第57-58页 |
| 4.4 游离P123的加入对MCS的抗解离作用的影响 | 第58页 |
| 5 本章小结 | 第58页 |
| 参考文献 | 第58-61页 |
| 第三章 MCS载体系统作为基因递送载体的研究 | 第61-99页 |
| 1 试剂与仪器 | 第61-62页 |
| 2 实验方法 | 第62-65页 |
| 2.1 各种PPI/DNA、Plu-PPI/DNA复合物的制备 | 第62页 |
| 2.2 复合物的扫描电镜和原子力显微镜考察 | 第62-63页 |
| 2.3 细胞的培养 | 第63页 |
| 2.4 细胞的转染 | 第63页 |
| 2.5 MCS细胞毒性的测定 | 第63-64页 |
| 2.6 流式细胞仪法评价绿色荧光蛋白报告基因细胞体外转染效率 | 第64页 |
| 2.7 虫荧光素酶活性的测定 | 第64页 |
| 2.8 荧光分光光度计法定量绿色荧光蛋白 | 第64页 |
| 2.9 MCF7/Adr转染治疗质粒后对R123摄取的测定 | 第64-65页 |
| 2.10 MCS作为报告基因pGL3-promoter递送载体的体内研究 | 第65页 |
| 3 实验结果 | 第65-87页 |
| 3.1 透射电镜观察MCS复合物的形态 | 第65-66页 |
| 3.2 原子力显微镜观察MCS复合物的形态 | 第66-67页 |
| 3.3 MCS复合物的细胞毒性 | 第67-68页 |
| 3.4 MCS作为绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2递送载体的研究 | 第68-79页 |
| 3.4.1 P123-2.5g-PPI与PPI在N/P比10时转染效率的比较 | 第68-69页 |
| 3.4.2 不同N/P比时P123-PPI对SPC-Al细胞的转染 | 第69-71页 |
| 3.4.3 N/P比10和20时添加游离P123对SPC-Al细胞的转染 | 第71-74页 |
| 3.4.4 P123-2.5g-PPI对CHO细胞的转染 | 第74-75页 |
| 3.4.5 P123-2.5g-PPI对293T细胞的转染 | 第75-76页 |
| 3.4.6 P123-2.5g-PPI对MCF7细胞的转染 | 第76-78页 |
| 3.4.7 P123-2.5g-PPI对MCF7/Adr细胞的转染 | 第78-79页 |
| 3.5 MCS作为虫荧光素酶报告基因pGL3-promoter递送载体的研究 | 第79-81页 |
| 3.6 血清和白蛋白对转染效率的影响 | 第81-83页 |
| 3.7 MCS作为治疗基因pRNAT递送载体的研究 | 第83-86页 |
| 3.8 MCS作为报告基因pGL3-promoter递送载体的体内转染效果 | 第86-87页 |
| 4 讨论 | 第87-92页 |
| 4.1 游离P123对转染效率的影响与体系中FBS存在与否密切相关 | 第87页 |
| 4.2 MCS中添加游离P123对转染效率的影响 | 第87-88页 |
| 4.3 MCS的转染效率与转染体系中FBS的浓度密切相关 | 第88-89页 |
| 4.4 MCS转染MCF/Adr后显著增加细胞对R123的摄取 | 第89-90页 |
| 4.5 MCS载体系统的体内转染 | 第90-92页 |
| 5 本章小结 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-99页 |
| 第四章 P123-PPI作为siRNA递送载体的初步研究 | 第99-112页 |
| 1 试剂与仪器 | 第99页 |
| 2 实验方法 | 第99-102页 |
| 2.1 优化P123-PPI/siRNA递送系统 | 第99-100页 |
| 2.1.1 最佳N/P比的优化 | 第99-100页 |
| 2.1.2 载体系统中游离P123量的优化 | 第100页 |
| 2.2 P123-PPI/siRNA复合物治疗MCF7/Adr后mRNA测定 | 第100-102页 |
| 2.2.1 RNA的抽提 | 第100页 |
| 2.2.2 cDNA的制备 | 第100-101页 |
| 2.2.3 实时定量RT-PCR检测MDR1基因表达 | 第101-102页 |
| 2.3 P123-PPI/siRNA复合物治疗MCF7/Adr后罗丹明的摄取 | 第102页 |
| 3 实验结果 | 第102-109页 |
| 3.1 优化P123-PPI/siRNA递送系统 | 第102-105页 |
| 3.2 P123-PPI/siRNA复合物治疗MCF7/Adr后mRNA测定 | 第105-106页 |
| 3.3 P123-PPI/siRNA复合物治疗MCF7/Adr后细胞对罗丹明的摄取 | 第106-109页 |
| 4 讨论 | 第109-110页 |
| 5 本章小结 | 第110页 |
| 参考文献 | 第110-112页 |
| 第五章 MCS载体系统细胞穿膜机理的研究 | 第112-129页 |
| 1 试剂与仪器 | 第112-113页 |
| 2 实验方法 | 第113-116页 |
| 2.1 MCS的复合物的制备 | 第113页 |
| 2.2 细胞及细胞培养 | 第113页 |
| 2.3 内吞抑制剂对MCS复合物内吞的影响 | 第113-114页 |
| 2.4 内吞抑制剂对MCS复合物转染效率的影响 | 第114-115页 |
| 2.5 MCS复合物摄取和转染的时间效应考察 | 第115页 |
| 2.6 四甲基罗丹明标记转铁蛋白的合成 | 第115页 |
| 2.7 YOYO-1标记质粒DNA | 第115页 |
| 2.8 MCS复合物与内吞标记物TRITC-Tf和Alexa Fluor555-CTB的共定位 | 第115-116页 |
| 3 试验结果 | 第116-122页 |
| 3.1 内吞抑制剂对细胞摄取MCS的影响 | 第116-118页 |
| 3.2 内吞抑制剂对MCS转染效率的影响 | 第118-120页 |
| 3.3 孵育温度和时间对MCS摄取和转染效率的影响 | 第120-121页 |
| 3.4 MCS复合物与内吞标记物的共定位 | 第121-122页 |
| 4 讨论 | 第122-125页 |
| 5 本章小结 | 第125页 |
| 参考文献 | 第125-129页 |
| 第六章 MCS载体系统细胞转运过程的研究 | 第129-146页 |
| 1 试剂与仪器 | 第129-130页 |
| 2 实验方法 | 第130-132页 |
| 2.1 MCS复合物的制备 | 第130页 |
| 2.2 细胞及细胞培养 | 第130页 |
| 2.3 抑制剂对MCS转染效率的影响 | 第130-131页 |
| 2.4 质粒DNA的罗丹明标记 | 第131页 |
| 2.5 MCS复合物与内酶体.溶酶体系统的共定位考察 | 第131页 |
| 2.6 MCS复合物与微管的共定位研究 | 第131-132页 |
| 3 实验结果 | 第132-138页 |
| 3.1 细胞骨架抑制剂对MCS转染效率的影响 | 第132-133页 |
| 3.2 内酶体-溶酶体系统酸化抑制剂对MCS转染效率的影响 | 第133-134页 |
| 3.3 动力蛋白抑制剂对转染效率的影响 | 第134-135页 |
| 3.4 MCS复合物与内酶体-溶酶体系统的共定位 | 第135-136页 |
| 3.5 MCS复合物与微管的免疫荧光共定位 | 第136-138页 |
| 4 讨论 | 第138-141页 |
| 5 小结 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-146页 |
| 结语 | 第146-150页 |
| 在校期间发表论文 | 第150-151页 |
| 致谢 | 第151-153页 |
| 附件 | 第153-176页 |
