| 目录 | 第3-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章：绪论 | 第10-19页 |
| 1.蛋白质定向进化技术 | 第10-14页 |
| 1.1 蛋白质定向进化技术原理和研究现状 | 第10-13页 |
| 1.2 蛋白质体内定向进化技术 | 第13-14页 |
| 2.酿酒酵母的遗传工程 | 第14页 |
| 3.纤维素酶的分类和工业应用 | 第14-18页 |
| 3.1 纤维素结构 | 第15页 |
| 3.2 纤维素酶分类 | 第15-16页 |
| 3.3 纤维素酶结构 | 第16-17页 |
| 3.4 纤维素酶应用 | 第17-18页 |
| 3.4.1 纺织 | 第17页 |
| 3.4.2 酿酒 | 第17-18页 |
| 3.4.3 饲料 | 第18页 |
| 3.4.4 其它 | 第18页 |
| 4.本工作的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 酿酒酵母致突变菌株的构建及参数测定 | 第19-49页 |
| 1 导言 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-37页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第20-21页 |
| 2.2 分子克隆用酶和试剂 | 第21页 |
| 2.3 培养基 | 第21-22页 |
| 2.4 DNA常规操作 | 第22-23页 |
| 2.5 H_2O_2诱导条件下酵母菌致突变菌株存活率的测定 | 第23页 |
| 2.6 致突变菌株突变率的计算 | 第23-37页 |
| 2.6.1 质粒pGADT7—kan的构建 | 第25-26页 |
| 2.6.2 点突变使kanamycin抗性基因使之失活 | 第26-35页 |
| 2.6.2.1 点突变试剂盒内容 | 第28-29页 |
| 2.6.2.2 选择性寡聚核糖核苷酸(Selection oligonucleotides) | 第29-30页 |
| 2.6.2.3 材料准备 | 第30页 |
| 2.6.2.4 引物与模板杂交 | 第30-31页 |
| 2.6.2.5 模板DNA的准备 | 第31页 |
| 2.6.2.6 杂交反应体系 | 第31-32页 |
| 2.6.2.7 合成与连接 | 第32-33页 |
| 2.6.2.8 验证感受态细胞效率 | 第33页 |
| 2.6.2.9 转化感受态细胞BMH 71-18mutS | 第33-34页 |
| 2.6.2.10 提取质粒： | 第34页 |
| 2.6.2.11 转化感受态细胞JM109 | 第34-35页 |
| 2.6.2.12 转化子测序及抗性的验证 | 第35页 |
| 2.6.3 致突变菌株kanamycin抗性回复突变率的测定 | 第35-37页 |
| 3 结果与讨论 | 第37-49页 |
| 3.1 致突变菌株的构建 | 第37页 |
| 3.2 致突变菌株回复突变率的测定 | 第37-43页 |
| 3.2.1 质粒pGADT7—kan的构建 | 第37-40页 |
| 3.2.2 点突变kanamycin抗性基因 | 第40-41页 |
| 3.2.3 点突变结果验证 | 第41-43页 |
| 3.3 kanamycin抗性基因回复突变率的测定 | 第43-49页 |
| 3.3.1 不同H_2O_2浓度诱导条件下致突变菌株存活率和回复突变率测定 | 第43-45页 |
| 3.3.2 不同H_2O_2处理时间条件下存活率和回复突变率的测定 | 第45-49页 |
| 第三章 瑞氏木霉内切纤维素酶基因EGⅢ在致突变菌株中的体内定向进化 | 第49-66页 |
| 1 导言 | 第49-50页 |
| 2 材料与方法 | 第50-56页 |
| 2.1 菌种和质粒 | 第50页 |
| 2.2 分子克隆用酶和试剂 | 第50-51页 |
| 2.3 培养基 | 第51页 |
| 2.4 DNA操作 | 第51页 |
| 2.5 表达质粒pGADT7—egⅢ的构建 | 第51-54页 |
| 2.5.1 引物设计 | 第52-53页 |
| 2.5.2 去磷酸化处理 | 第53页 |
| 2.5.3 egⅢPCR产物酶切连接构建pGADT7—egⅢ质粒 | 第53页 |
| 2.5.4 pGADT7—egⅢ质粒的酶切验证 | 第53-54页 |
| 2.6 pGADT7—egⅢ转化酿酒酵母致突变菌株 | 第54页 |
| 2.7 刚果红染色 | 第54-55页 |
| 2.9 SDS电泳检测发酵液中内切酶 | 第55页 |
| 2.10 活性染色 | 第55页 |
| 2.11 内切酶酶活性测定 | 第55-56页 |
| 3 结果与讨论 | 第56-66页 |
| 3.1 PCR扩增瑞氏木霉内切纤维素酶EGⅢ基因 | 第56-57页 |
| 3.2 pGADT7—egⅢ的构建 | 第57-59页 |
| 3.3 pGADT7—egⅢ转化酿酒酵母致突变菌株 | 第59页 |
| 3.4 刚果红染色筛选 | 第59-60页 |
| 3.5 酶活性测定 | 第60-61页 |
| 3.6 SDS电泳与活性染色检测目的蛋白 | 第61-62页 |
| 3.7 测序 | 第62-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
