| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 论文缩写词及英汉对照 | 第7-12页 |
| 1 前言 | 第12-17页 |
| 1.1 滞育及滞育机制研究现状 | 第12-14页 |
| 1.1.1 滞育相关生理生化研究 | 第12-13页 |
| 1.1.2 生态环境对滞育相关研究 | 第13页 |
| 1.1.3 滞育相关分子生物学研究 | 第13-14页 |
| 1.1.4 滞育解除相关的研究 | 第14页 |
| 1.2 氯离子通道蛋白研究现状 | 第14-15页 |
| 1.3 本研究的内容和意义 | 第15-16页 |
| 1.4 本文研究的技术路线 | 第16-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-32页 |
| 2.1 材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 家蚕、载体和菌株 | 第17页 |
| 2.1.2 主要药品试剂 | 第17页 |
| 2.1.3 主要试剂盒 | 第17页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第17-18页 |
| 2.1.5 主要试剂的配置 | 第18-19页 |
| 2.2 方法 | 第19-32页 |
| 2.2.1 蚕卵的处理和取样 | 第19-20页 |
| 2.2.2 候选基因的克隆 | 第20-27页 |
| 2.2.2.1 候选基因的引物设计 | 第20-21页 |
| 2.2.2.2 蚕卵总RNA提取 | 第21页 |
| 2.2.2.3 RNA琼脂糖电泳 | 第21页 |
| 2.2.2.4 cDNA第一链的合成 | 第21-22页 |
| 2.2.2.5 cDNA的检测和候选基因的扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.2.6 目的基因PCR扩增产物的纯化回收 | 第23-24页 |
| 2.2.2.7 目的片段与PMD19-T载体相连： | 第24页 |
| 2.2.2.8 感受态细胞的制备 | 第24页 |
| 2.2.2.9 重组质粒转化受体菌 | 第24-25页 |
| 2.2.2.10 重组质粒的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2.11 阳性重组转化子的PCR鉴定及双酶切鉴定 | 第26页 |
| 2.2.2.12 重组转化子双酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.3 目的基因Real-time PCR | 第27-29页 |
| 2.2.3.1 目的基因Real-time PCR引物设计 | 第27页 |
| 2.2.3.2 蚕卵总RNA提取 | 第27-28页 |
| 2.2.3.3 RNA逆转录 | 第28页 |
| 2.2.3.4 cDNA的验证和引物特异性验证 | 第28-29页 |
| 2.2.3.5 Real-time PCR | 第29页 |
| 2.2.5 家蚕滞育和滞育解除蚕卵四种辅酶的分析 | 第29-32页 |
| 2.2.5.1 蚕卵全蛋白的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.5.2 Bradford法蛋白浓度的测定 | 第30页 |
| 2.2.5.3 蚕卵乙酰辅酶A的检测 | 第30页 |
| 2.2.5.4 昆虫黄素腺嘌呤二核苷酸检测 | 第30页 |
| 2.2.5.5 辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ检测 | 第30-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-49页 |
| 3.1 不同处理蚕卵的孵化情况 | 第32-33页 |
| 3.1.1 浸酸时间与孵化率的关系 | 第32页 |
| 3.1.2 DMSO浸渍时间与孵化率的关系 | 第32-33页 |
| 3.1.3 冷藏后浸酸时间与孵化率的关系 | 第33页 |
| 3.2 候选基因的克隆 | 第33-37页 |
| 3.2.1 候选基因分析 | 第33-34页 |
| 3.2.2 提取的蚕卵总RNA鉴定 | 第34-35页 |
| 3.2.3 内参基因的PCR鉴定 | 第35页 |
| 3.2.4 候选基因的PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2.5 候选基因的克隆及重组质粒PCR鉴定 | 第36-37页 |
| 3.2.6 重组质粒的双酶切鉴定 | 第37页 |
| 3.2.7 重组质粒的测序鉴定 | 第37页 |
| 3.3 候选基因在932蚕卵中的表达分析 | 第37-46页 |
| 3.3.1 Real-time PCR引物特异性验证和cDNA验证 | 第37-39页 |
| 3.3.2 Real-time PCR溶解曲线和扩增曲线 | 第39页 |
| 3.3.3 候选基因在蚕卵浸酸不同时间的表达分析 | 第39-41页 |
| 3.3.3.1 BmCLIC基因在浸酸不同时间后的表达情况 | 第39页 |
| 3.3.3.2 BmGluCl基因在浸酸不同时间后的表达情况 | 第39-40页 |
| 3.3.3.3 Bmγ-Cl基因在浸酸不同时间后的表达情况 | 第40-41页 |
| 3.3.5 候选基因滞育卵和处理卵中的表达分析 | 第41-43页 |
| 3.3.5.1 BmCLIC基因在滞育卵、即时浸酸卵和DMSO处理卵发育中表达变化 | 第41页 |
| 3.3.5.2 BmGluCl基因在滞育卵、即时浸酸卵和DMSO处理卵发育中表达变化 | 第41-42页 |
| 3.3.5.3 Bmγ-Cl基因在滞育卵、即时浸酸卵和DMSO处理卵发育中表达变化 | 第42-43页 |
| 3.3.6 候选基因在蚕卵冷藏后浸酸不同时间的表达分析 | 第43-45页 |
| 3.3.6.1 BmCLIC在冷藏后浸酸不同时间后的表达情况 | 第43页 |
| 3.3.6.2 BmGluCl在冷藏后浸酸不同时间后的表达情况 | 第43-44页 |
| 3.3.6.3 Bmγ-Cl在冷藏后浸酸不同时间后的表达情况 | 第44-45页 |
| 3.3.7 候选基因在蚕卵冷藏解除滞育后的表达分析 | 第45-46页 |
| 3.3.7.1 BmCLIC在蚕卵冷藏解除滞育后的表达情况 | 第45页 |
| 3.3.7.2 BmGluCl在蚕卵冷藏解除滞育后胚胎发育过程中的表达情况 | 第45-46页 |
| 3.3.7.3 Bmγ-Cl在蚕卵冷藏解除滞育后胚胎发育过程中的表达情况 | 第46页 |
| 3.4 四种辅酶的变化 | 第46-49页 |
| 3.4.1 蚕卵发育过程中乙酰辅酶A变化 | 第46-47页 |
| 3.4.2 蚕卵发育过程中黄素腺嘌呤二核苷酸变化 | 第47-48页 |
| 3.4.3 辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ检测 | 第48-49页 |
| 4 结论与讨论 | 第49-54页 |
| 4.1 结论 | 第49页 |
| 4.2 讨论 | 第49-53页 |
| 4.2.1 不同的刺激量对蚕卵孵化率的影响 | 第49-50页 |
| 4.2.2 候选氯离子通道蛋白的研究 | 第50页 |
| 4.2.3 候选基因与家蚕滞育解除的关系 | 第50-52页 |
| 4.2.3.1 BmCLIC基因与家蚕滞育解除的关系 | 第50-51页 |
| 4.2.3.2 BmGluCl基因与家蚕滞育解除的关系 | 第51页 |
| 4.2.3.3 Bmγ-Cl基因与家蚕滞育解除关系 | 第51页 |
| 4.2.3.4 DMSO处理对候选基因表达量影响 | 第51-52页 |
| 4.2.4 辅酶在蚕卵发育过程中的变化 | 第52-53页 |
| 4.3 本文主要创新点 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考 文献 | 第55-59页 |
| 附录A 载体示意图 | 第59-60页 |
| 附录B 测序图谱及比对分析 | 第60-65页 |
| 附录C 荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线 | 第65-72页 |
| 附录D 目的基因在样品中的相对表达量 | 第72-78页 |
