| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 前言 | 第13-22页 |
| 1.1 链霉菌 | 第13-14页 |
| 1.2 链霉菌与抗生素 | 第14-15页 |
| 1.3 链霉菌基因组的特点 | 第15-16页 |
| 1.4 BIQ同族抗生素 | 第16-18页 |
| 1.5 抗生素合成相关的分子调控 | 第18-20页 |
| 1.6 放线紫红素中的调控基因actVI-ORFA | 第20页 |
| 1.7 BIQ手性结构与相关基因 | 第20-21页 |
| 1.8 本研究的目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-40页 |
| 2.1 菌株 | 第22-23页 |
| 2.2 质粒 | 第23-24页 |
| 2.3 培养基 | 第24-26页 |
| 2.3.1 大肠杆菌培养基 | 第24页 |
| 2.3.2 链霉菌培养基 | 第24-26页 |
| 2.4 试剂和溶液 | 第26-31页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取试剂 | 第26-27页 |
| 2.4.2 链霉菌DNA的提取 | 第27页 |
| 2.4.3 Tricine-SDS-PAGE试剂 | 第27-28页 |
| 2.4.4 缓冲液 | 第28页 |
| 2.4.5 其他试剂 | 第28页 |
| 2.4.6 酶和生化试剂 | 第28-29页 |
| 2.4.7 抗生素 | 第29页 |
| 2.4.8 实验中所用的引物 | 第29-31页 |
| 2.5 实验方法 | 第31-40页 |
| 2.5.1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第31页 |
| 2.5.2 大肠杆的菌感受态细胞制备及转化 | 第31-32页 |
| 2.5.3 大肠杆菌菌种的保存 | 第32页 |
| 2.5.4 DNA体外操作 | 第32页 |
| 2.5.5 链霉菌的培养及常规操作 | 第32-34页 |
| 2.5.6 Tricine-SDS- PAGE | 第34页 |
| 2.5.7 Western blot | 第34-35页 |
| 2.5.8 非变性蛋白纯化(His标签) | 第35-36页 |
| 2.5.9 切胶制备抗体 | 第36页 |
| 2.5.10 链霉菌发酵产物提取 | 第36页 |
| 2.5.11 HPLC分析条件 | 第36页 |
| 2.5.12 总RNA的反转录 | 第36-37页 |
| 2.5.13 实时荧光定量PCR | 第37-39页 |
| 2.5.14 蛋白质双向电泳 | 第39-40页 |
| 第三章 调控基因actVI—ORFA缺失突变菌的蛋白组学研究和靶基因RT-PCR分析 | 第40-54页 |
| 3.1 野生型菌株J1501/PIJ8600及actVI-ORFA缺失型菌株VI-A/pIJ8600蛋白组学实验方案 | 第40-47页 |
| 3.1.1 菌株的鉴定 | 第40-42页 |
| 3.1.2 菌株大量培养 | 第42页 |
| 3.1.3 蛋白质双向电泳 | 第42-44页 |
| 3.1.4 质谱分析 | 第44-47页 |
| 3.2 RT-PCR验证 | 第47-52页 |
| 3.2.1 RNA的提取 | 第47-48页 |
| 3.2.2 基因组DNA的去除及RNA的反转录 | 第48页 |
| 3.2.3 RT-PCR引物设计 | 第48页 |
| 3.2.4 合成的cDNA效果检测 | 第48-49页 |
| 3.2.5 荧光定量PCR扩增hrdB、actVI-ORF1及actVI-ORF4 | 第49-51页 |
| 3.2.6 基因actVI-ORF1及actVI-ORF4相对表达量 | 第51-52页 |
| 3.3 本章讨论 | 第52-54页 |
| 3.3.1 actVI-ORFA敲出菌蛋白组学分析 | 第52-53页 |
| 3.3.2 actVI-ORFA与放线紫红素合成基因 | 第53-54页 |
| 第四章 美达霉素生物合成过程中烯酰还原酶基因med-ORF29的功能初探 | 第54-72页 |
| 4.1 med-ORF29的敲除 | 第54-63页 |
| 4.1.1 野生型菌株med-ORF29敲除与互补实验方案 | 第54-55页 |
| 4.1.2 自杀质粒构建示意图 | 第55-56页 |
| 4.1.3 自杀质粒的构建 | 第56-57页 |
| 4.1.4 自杀质粒的构建与验证 | 第57-59页 |
| 4.1.5 接合转移进行同源重组 | 第59页 |
| 4.1.6 med-ORF29敲除菌株筛选 | 第59-62页 |
| 4.1.7 筛选所得菌株液相色谱分析 | 第62-63页 |
| 4.2 Med-29超量表达 | 第63-67页 |
| 4.2.1 实验流程 | 第63页 |
| 4.2.2 超量表达菌株的构建 | 第63-65页 |
| 4.2.3 超量表达菌株AM-7161/PHSL144分子水平验证 | 第65-67页 |
| 4.3 Med-ORF29蛋白纯化及抗体的制备 | 第67-71页 |
| 4.3.1 Med-ORF29蛋白诱导表达条件确定及纯化条件探索 | 第67-68页 |
| 4.3.2 Med-ORF29抗体制备 | 第68-69页 |
| 4.3.3 利用制备多克隆抗体来检测野生型链霉菌中Med-ORF29的表达情况 | 第69-71页 |
| 4.4 本章讨论 | 第71-72页 |
| 总结与展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 硕士期间发表论文 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
