| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 前言 | 第14-25页 |
| 1.1 链霉菌 | 第14-15页 |
| 1.2 抗生素和美达霉素 | 第15-19页 |
| 1.2.1 抗生素 | 第15-16页 |
| 1.2.2 聚酮类抗生素 | 第16-17页 |
| 1.2.3 美达霉素 | 第17-19页 |
| 1.3 烯酰还原酶 | 第19-22页 |
| 1.4 链霉菌次级代谢的调控 | 第22-24页 |
| 1.5 本研究的内容和意义 | 第24-25页 |
| 第二章 材料与方法 | 第25-40页 |
| 2.1 菌株 | 第25-26页 |
| 2.2 质粒 | 第26-27页 |
| 2.3 培养基 | 第27-29页 |
| 2.3.1 大肠杆菌培养基 | 第27页 |
| 2.3.2 链霉菌培养基 | 第27-29页 |
| 2.4 试剂和溶液 | 第29-33页 |
| 2.4.1 大肠杆菌质粒提取试剂 | 第29-30页 |
| 2.4.2 链霉菌DNA的提取 | 第30页 |
| 2.4.3 Tricine-SDS-PAGE试剂(分离小蛋白) | 第30页 |
| 2.4.4 Western blot试剂 | 第30-31页 |
| 2.4.5 缓冲液 | 第31页 |
| 2.4.6 其他试剂 | 第31-32页 |
| 2.4.7 酶和生化试剂 | 第32页 |
| 2.4.8 抗生素 | 第32-33页 |
| 2.5 实验方法 | 第33-40页 |
| 2.5.1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第33页 |
| 2.5.2 大肠杆菌感受态细胞制备(cac12法)和转化(热激法) | 第33-34页 |
| 2.5.3 大肠杆菌菌种的保存 | 第34页 |
| 2.5.4 DNA的体外操作 | 第34页 |
| 2.5.5 链霉菌的培养 | 第34-35页 |
| 2.5.6 大肠杆菌与链霉菌的接合转移 | 第35页 |
| 2.5.7 链霉菌的发酵 | 第35页 |
| 2.5.8 发酵液的粗提取 | 第35-36页 |
| 2.5.9 HPLC及LC/MS分析 | 第36页 |
| 2.5.10 链霉菌RNA的提取步骤(百泰克总RNA快速提取试剂盒) | 第36页 |
| 2.5.11 总RNA的反转录 | 第36-37页 |
| 2.5.12 实时荧光定量PCR | 第37-38页 |
| 2.5.13 免疫共沉淀 | 第38-40页 |
| 第三章 美达霉素生物合成后期修饰基因med-ORF9的功能研究 | 第40-62页 |
| 3.1 med-ORF9超表达菌株的构建 | 第40-44页 |
| 3.1.1 超表达质粒的构建 | 第40-42页 |
| 3.1.2 突变位点的校正 | 第42-43页 |
| 3.1.3 超表达质粒的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.4 大肠杆菌与野生菌的接合转移 | 第44页 |
| 3.1.5 超表达菌株的验证 | 第44页 |
| 3.2 野生型菌株与超表达菌株的分析 | 第44-47页 |
| 3.3 med-ORF9缺失突变菌株的构建 | 第47-51页 |
| 3.3.1 自杀型敲除质粒的构建 | 第47-50页 |
| 3.3.2 通过结合转移将自杀型敲除质粒导入野生菌中 | 第50-51页 |
| 3.4 med-ORF9缺失菌的验证 | 第51-53页 |
| 3.5 野生型菌株与缺失突变菌株的分析 | 第53-54页 |
| 3.6 Med-ORF9的原核表达 | 第54-60页 |
| 3.6.1 med-ORF9原核表达质粒的构建 | 第54-56页 |
| 3.6.2 初步诱导表达Med-ORF9蛋白 | 第56-57页 |
| 3.6.3 更换表达载体构建表达质粒 | 第57-59页 |
| 3.6.4 初步诱导表达Med-ORF9蛋白 | 第59-60页 |
| 3.7 讨论 | 第60-62页 |
| 第四章 美达霉素生物合成中一个调控基因作用机制的研究 | 第62-79页 |
| 4.1 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测med-ORF10对相关基因的表达调控 | 第62-68页 |
| 4.1.1 qRT-PCR引物的设计 | 第62-63页 |
| 4.1.2 RNA的提取 | 第63-64页 |
| 4.1.3 cDNA效果检测 | 第64-65页 |
| 4.1.4 qRT-PCR检测med-ORF10对相关基因表达的调控 | 第65-67页 |
| 4.1.5 qRT-PCR检测med-ORF11对相关基因表达的调控 | 第67-68页 |
| 4.2 med-ORF10的融合表达 | 第68-74页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第69页 |
| 4.2.2 构建融合蛋白表达质粒 | 第69-71页 |
| 4.2.3 大肠杆菌与AM7161的接合转移 | 第71页 |
| 4.2.4 融合蛋白表达菌株的验证 | 第71-72页 |
| 4.2.5 med-ORF10融合蛋白的表达 | 第72页 |
| 4.2.6 med-ORF10融合蛋白的检测 | 第72-74页 |
| 4.3 免疫共沉淀检测与Med- ORF10相互作用的蛋白 | 第74-77页 |
| 4.3.1 样品的制备 | 第75页 |
| 4.3.2 Western blot监测 | 第75-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-79页 |
| 总结与展望 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-86页 |
| 硕士期间论文发表 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
