| 硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 英文縮略表 | 第15-16页 |
| 第一章 引言 | 第16-23页 |
| ·RHDV概述 | 第16页 |
| ·RHDV的分子生物学 | 第16-17页 |
| ·RHDV基因组的编码蛋白及功能 | 第17-18页 |
| ·RHDV的受体与宿主 | 第18-19页 |
| ·RHDV的变异 | 第19-21页 |
| ·血凝性 | 第19-20页 |
| ·致病性变异 | 第20页 |
| ·RHDV遗传演化的分子基础 | 第20-21页 |
| ·RHDV的流行病学调查 | 第21-22页 |
| ·结语 | 第22-23页 |
| 第二章 兔出血症病毒NSP1蛋白的原核表达和抗体制备 | 第23-32页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·质粒、菌株和细胞株 | 第24页 |
| ·主要实验试剂 | 第24-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·实验方法 | 第25-29页 |
| ·NSP1基因的扩增 | 第25-26页 |
| ·pGEX-NSP1原核表达重组质粒的构建和鉴定 | 第26-27页 |
| ·胶回收产物的酶切处理 | 第26页 |
| ·表达载体的酶切处理 | 第26页 |
| ·酶切后的目的基因和表达载体的纯化 | 第26页 |
| ·目的基因和表达载体的连接 | 第26页 |
| ·转化 | 第26-27页 |
| ·质粒的提取 | 第27页 |
| ·质粒酶切鉴定 | 第27页 |
| ·NSP1蛋白的原核表达及纯化 | 第27-28页 |
| ·阳性重组质粒转化BL21感受态细胞pGEX-NSP1质粒 | 第27页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第27-28页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析及Western-blot检测 | 第28-29页 |
| ·SDS-PAGE 胶配方 | 第28页 |
| ·表达产物的WB检测 | 第28-29页 |
| ·抗NSP1多克隆抗体的制备 | 第29页 |
| ·多克隆抗体的检测 | 第29页 |
| ·结果 | 第29-31页 |
| ·NSP1基因的扩增 | 第29页 |
| ·pGEX-NSP1原核表达载体的鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组蛋白GST-NSP1在宿主菌中的表达 | 第30页 |
| ·重组蛋白NSP1多克隆抗体的制备与检测 | 第30-31页 |
| ·讨论 | 第31-32页 |
| 第三章 兔出血症病毒NSP1蛋白的亚细胞定位 | 第32-37页 |
| ·材料 | 第32页 |
| ·质粒、菌株和细胞株 | 第32页 |
| ·主要实验试剂 | 第32页 |
| ·主要仪器 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-33页 |
| ·pEGFP-NSP1真核表达重组质粒的构建 | 第32-33页 |
| ·细胞培养以及重组质粒的转染 | 第33页 |
| ·用激光共聚焦显微镜观察NSP1在细胞中的定位 | 第33页 |
| ·结果 | 第33-35页 |
| ·表达载体的鉴定 | 第33-34页 |
| ·NSP1在RK13细胞中的定位研究 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35-37页 |
| 第四章 RHDVNSP1与其它非结构蛋白之间的相互作用 | 第37-44页 |
| ·材料 | 第38页 |
| ·双杂交系统、菌株和细胞株 | 第38页 |
| ·主要实验试剂 | 第38页 |
| ·主要仪器 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-41页 |
| ·引物的设计与合成和基因的获得 | 第38-39页 |
| ·引物的设计 | 第38-39页 |
| ·目的基因的获得 | 第39页 |
| ·重组质粒的构建 | 第39-40页 |
| ·转染质粒的获得 | 第40页 |
| ·细胞转染 | 第40页 |
| ·荧光值检测的方法 | 第40-41页 |
| ·细胞的裂解 | 第40-41页 |
| ·荧光值的检测 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-43页 |
| ·NSP1至NSP7基因的扩增 | 第41页 |
| ·重组质粒的构建 | 第41-42页 |
| ·荧光素酶值的检测 | 第42-43页 |
| ·讨论 | 第43-44页 |
| 第五章 应用反向遗传学方法研究NSP1与病毒翻译的关系 | 第44-51页 |
| ·材料 | 第44-45页 |
| ·细胞株和菌株 | 第44页 |
| ·主要实验试剂 | 第44-45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-47页 |
| ·重组质粒构建 | 第45-46页 |
| ·质粒大量抽提 | 第46页 |
| ·转染 | 第46页 |
| ·建立pRHDV-rFluc的生长曲线 | 第46页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第46-47页 |
| ·结果 | 第47-49页 |
| ·RHDV复制子构建的鉴定 | 第47-48页 |
| ·缺失序列复制子构建的鉴定 | 第48页 |
| ·生长曲线以及荧光值结果的检测 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-51页 |
| 第六章 RHDV的NSP1端序列与病毒蛋白翻译功能的初步研究 | 第51-58页 |
| ·材料与方法 | 第51-52页 |
| ·质粒、菌株和细胞株 | 第51页 |
| ·主要实验试剂 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-53页 |
| ·引物设计与合成 | 第52页 |
| ·双顺反子载体的构建 | 第52-53页 |
| ·细胞培养以及重组质粒的转染 | 第53页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第53页 |
| ·结果 | 第53-57页 |
| ·双顺反子质粒载体的构建及鉴定 | 第53-55页 |
| ·含有RHDV部分RNA序列的双顺反子质粒载体的构建及鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组质粒转染RK13细胞荧光值结果分析 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| 第七章 全文结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 作者简历 | 第64页 |
