| 中国农业科学院博上学位论文评阅人、答辩委员会签名表 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 图表清单 | 第14-16页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-26页 |
| ·布鲁氏菌研究概况 | 第17-18页 |
| ·概况 | 第17页 |
| ·分类 | 第17-18页 |
| ·传播途径 | 第18页 |
| ·布鲁氏菌主要毒力基因研究进展 | 第18-22页 |
| ·脂多糖（LPS） | 第18-19页 |
| ·四型分泌系统（T4SS） | 第19-20页 |
| ·双组份调控系统（BvrR/BvrS） | 第20页 |
| ·环β-1,2-葡聚糖 | 第20页 |
| ·超氧化物歧化酶（SOD） | 第20-21页 |
| ·过氧化氢酶 | 第21-22页 |
| ·其他毒力因子 | 第22页 |
| ·细菌毒力基因筛选方法 | 第22-25页 |
| ·生物信息学方法 | 第22-23页 |
| ·基因芯片技术 | 第23页 |
| ·转座子随机突变技术 | 第23页 |
| ·体内诱导技术 | 第23-24页 |
| ·差异荧光诱导 | 第24页 |
| ·体内诱导抗原技术 | 第24-25页 |
| ·转录序列选择性捕获技术 | 第25页 |
| ·其他筛选方法 | 第25页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 第二章 信号标签随机突变库筛选布鲁氏菌减毒突变株 | 第26-36页 |
| ·材料与方法 | 第27-31页 |
| ·菌株与试验动物 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| ·仪器 | 第27页 |
| ·溶液配制 | 第27-28页 |
| ·流产布鲁氏菌萘啶酸抗性菌株的筛选及毒力鉴定 | 第28页 |
| ·标签质粒 pUTmini-Tn5-Tag 的构建 | 第28-29页 |
| ·PCR 依赖的信号标签的交叉反应性 | 第29-30页 |
| ·信号标签随机突变库的构建 | 第30页 |
| ·减毒突变株的筛选 | 第30-31页 |
| ·减毒突变株插入失活基因鉴定 | 第31页 |
| ·结果 | 第31-34页 |
| ·流产布鲁氏菌诱导产生 Nal 抗性并保持原菌株对小鼠的毒力 | 第31-32页 |
| ·成功构建 8 个标签转座子质粒且 PCR 交叉反应为阴性 | 第32-33页 |
| ·标签突变库的构建 | 第33页 |
| ·减毒突变株的筛选 | 第33页 |
| ·减毒突变株的失活基因鉴定 | 第33-34页 |
| ·讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 流产布鲁氏菌 rfbE 缺失株的构建及致病性分析 | 第36-49页 |
| ·材料与方法 | 第36-40页 |
| ·菌株、细胞系及实验动物 | 第36-37页 |
| ·试剂 | 第37页 |
| ·仪器 | 第37页 |
| ·溶液配制 | 第37页 |
| ·自杀性质粒和互补质粒的构建 | 第37-38页 |
| ·缺失株和互补株的构建 | 第38页 |
| ·细菌表型鉴定 | 第38-39页 |
| ·生长曲线的测定 | 第39页 |
| ·粘附入侵和胞内存活试验 | 第39页 |
| ·间接免疫荧光试验 | 第39-40页 |
| ·细胞死亡鉴定 | 第40页 |
| ·对小鼠致病性分析 | 第40页 |
| ·结果 | 第40-46页 |
| ·质粒构建结果 | 第40页 |
| ·缺失株和互补株构建结果 | 第40-41页 |
| ·细菌表型鉴定结果 | 第41-42页 |
| ·生长曲线测定结果 | 第42-43页 |
| ·粘附入侵结果 | 第43页 |
| ·细胞胞内存活结果 | 第43-44页 |
| ·细胞坏死鉴定 | 第44-46页 |
| ·小鼠致病性分析结果 | 第46页 |
| ·讨论 | 第46-49页 |
| 第四章 布鲁氏菌 rfbE 缺失株酸休克蛋白上调机制及功能 | 第49-65页 |
| ·材料和方法 | 第50-55页 |
| ·菌株 | 第50页 |
| ·细胞 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50-52页 |
| ·溶液配制 | 第52页 |
| ·细菌 RNA 提取 | 第52页 |
| ·基因芯片分析及 qRT-PCR 验证 | 第52页 |
| ·质粒构建 | 第52-53页 |
| ·Asp24 蛋白表达 | 第53-54页 |
| ·Asp24 兔抗血清的制备 | 第54页 |
| ·布鲁氏菌突变株衍生株的构建 | 第54页 |
| ·细菌组分提取及免疫印迹试验 | 第54页 |
| ·细菌粘附入侵以及胞内存活测定方法 | 第54-55页 |
| ·细胞毒力及死亡类型鉴定 | 第55页 |
| ·细菌酸性诱导及耐酸性试验 | 第55页 |
| ·结果 | 第55-63页 |
| ·Asp24 蛋白在 rfbE 缺失株中出现明显上调表达 | 第55-57页 |
| ·Asp24 蛋白上调表达与 O-抗原在 rfbE 缺失株中胞内合成和积累有关 | 第57-59页 |
| ·Asp24 蛋白上调表达不是 rfbE 缺失株导致巨噬细胞肿胀和坏死的原因 | 第59-60页 |
| ·Asp24 蛋白在酸性条件下被诱导表达但与细菌酸性抵抗力无关 | 第60-61页 |
| ·改变 Asp24 蛋白表达量影响布鲁氏菌在宿主细胞内的存活 | 第61-63页 |
| ·讨论 | 第63-65页 |
| 第五章 基因芯片筛选流产布鲁氏菌胞内存活相关基因 | 第65-76页 |
| ·材料与方法 | 第66-69页 |
| ·菌种 | 第66页 |
| ·细胞 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66页 |
| ·仪器 | 第66页 |
| ·溶液配制 | 第66页 |
| ·细菌收集 | 第66-67页 |
| ·细菌总 RNA 提取 | 第67页 |
| ·标记和纯化 RNA | 第67页 |
| ·杂交 | 第67-68页 |
| ·芯片洗涤与扫描 | 第68页 |
| ·数据处理和分析 | 第68页 |
| ·qRT-PCR 验证芯片结果 | 第68页 |
| ·主要差异表达基因功能分类 | 第68-69页 |
| ·结果 | 第69-73页 |
| ·RNA 质量分析 | 第69页 |
| ·确定差异表达基因 | 第69-70页 |
| ·差异基因热图和聚类分析 | 第70-71页 |
| ·差异基因参与的代谢通路分析 | 第71页 |
| ·qRT-PCR 的验证和主要差异表达基因的功能分类 | 第71-73页 |
| ·讨论 | 第73-76页 |
| 第六章 流产布鲁氏菌 ddp 基因缺失株的构建及致病性分析 | 第76-87页 |
| ·材料与方法 | 第76-79页 |
| ·菌株与细胞系 | 第76页 |
| ·试剂 | 第76页 |
| ·仪器 | 第76-77页 |
| ·溶液配制 | 第77页 |
| ·自杀性质粒的构建 | 第77页 |
| ·缺失株构建 | 第77页 |
| ·细菌表型鉴定 | 第77页 |
| ·细菌 LPS 提取与免疫印迹鉴定 | 第77页 |
| ·ddp 缺失株粘附入侵试验 | 第77-78页 |
| ·ddp 缺失巨噬细胞内存活试验 | 第78页 |
| ·ddp 缺失株细胞毒性试验 | 第78页 |
| ·ddp 缺失株感染巨噬细胞细胞因子转录水平测定 | 第78页 |
| ·ddp 缺失株对小鼠致病性分析 | 第78-79页 |
| ·结果 | 第79-85页 |
| ·ddp 基因生物信息学分析 | 第79页 |
| ·缺失株的构建结果 | 第79页 |
| ·细菌表型分析结果 | 第79-81页 |
| ·免疫印迹鉴定细菌 LPS 结果 | 第81页 |
| ·细菌粘附入侵结果 | 第81页 |
| ·细菌胞内存活结果 | 第81-82页 |
| ·细胞毒性试验结果 | 第82-84页 |
| ·ddp 缺失株诱导巨噬细胞免疫相关因子转录水平分析 | 第84-85页 |
| ·ddp 缺失株对小鼠的致病性分析结果 | 第85页 |
| ·讨论 | 第85-87页 |
| 第七章 全文结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-101页 |
| 附录 | 第101-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 作者简历 | 第106页 |
