| 中文摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-13页 |
| CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION | 第13-24页 |
| ·Nitrate uptake and reduction | 第14页 |
| ·Structure of NR | 第14-15页 |
| ·Transcriptional regulation of NR | 第15-17页 |
| ·Nitrate | 第16页 |
| ·Light | 第16-17页 |
| ·Carbohydrates | 第17页 |
| ·Post-transcriptional regulation of NR | 第17页 |
| ·Post-translational regulation of NR | 第17-18页 |
| ·Structure of NiR | 第18-19页 |
| ·Transcriptional regulation of NiR | 第19-20页 |
| ·Nitrate | 第19页 |
| ·Light | 第19-20页 |
| ·Carbohydrates | 第20页 |
| ·Post-transcriptional regulation of NiR | 第20-21页 |
| ·Tissue specific expression of NiR | 第21页 |
| ·Pollution problems and toxicity of nitrate and nitrite | 第21-22页 |
| ·TSNA and its relationship with NR and NiR | 第22-23页 |
| ·Objectives | 第23-24页 |
| CHAPTER Ⅱ MATERIALS AND METHODS | 第24-40页 |
| ·Technical route of current research | 第24-25页 |
| ·Total RNA isolation | 第25页 |
| ·Purification of total RNA | 第25-26页 |
| ·Single-strand cDNA synthesis | 第26页 |
| ·PCR amplification of nii genes | 第26-27页 |
| ·Gel purification of PCR products by agarose gel purification kit | 第27页 |
| ·Cloning vector construction | 第27-28页 |
| ·Preparation of E. coli DH5a competent cells | 第28页 |
| ·Transformation into E. coli (heat shock method) | 第28-29页 |
| ·Extraction of plasmid by alkaline lysis method | 第29页 |
| ·Verification of positive cloning vector | 第29-30页 |
| ·Preparation of Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 competent cells | 第30页 |
| ·Ligation into pBI121 expression vector | 第30-31页 |
| ·Transformation into LBA 4404 (freeze-thaw method) | 第31页 |
| ·Transformation and regeneration of transgenic plants | 第31-32页 |
| ·Electrophoresis of DNA (Agarose gel electrophoresis) | 第32页 |
| ·Genomic DNA extraction | 第32-33页 |
| ·PCR-based screening method for transgenic tobacco plants | 第33页 |
| ·Culture of T! and T2 plants | 第33-34页 |
| ·Semi-quantitative RT-PCR | 第34页 |
| ·Protein determination (Bradford method) | 第34-35页 |
| ·In vivo analysis of nitrate reductase activity | 第35-38页 |
| ·In vitro analysis of nitrate reductase activity | 第38页 |
| ·Nitrite reductase activity | 第38-39页 |
| ·Determination of nitrate levels in plant tissue | 第39页 |
| ·Determination of nitrite content in plant tissue | 第39-40页 |
| CHAPTER Ⅲ Molecular cloning of nii genes, and construction of plant expression vector | 第40-45页 |
| ·Introduction | 第40-41页 |
| ·Results | 第41-45页 |
| ·Molecular cloning of NiR genes from N. tabucum | 第41页 |
| ·Ligation into pMD18-T vector | 第41-42页 |
| ·Construction of expression vector | 第42-45页 |
| CHAPTER Ⅳ Transformation, regeneration and molecular characterization of transgenic plants | 第45-51页 |
| ·Introduction | 第45-46页 |
| ·Results | 第46-51页 |
| ·Transformation, regeneration of transgenic plants | 第46-47页 |
| ·Identification of transgenic plants by PCR | 第47-48页 |
| ·Determination of gene expression by semi-quantitative RT-PCR | 第48-51页 |
| CHAPTER Ⅴ Study of physiological characters in transgenic plants | 第51-57页 |
| ·Introduction | 第51-52页 |
| ·Results | 第52-57页 |
| ·Protein determination | 第52页 |
| ·Determination of nitrate reductase activity | 第52-54页 |
| ·Estimation of nitrate content | 第54-55页 |
| ·Determination of NiR enzyme activity | 第55页 |
| ·Estimation of nitrite content | 第55-57页 |
| DISCUSSION | 第57-60页 |
| CONCLUSION | 第60-61页 |
| REFERENCES | 第61-69页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第69-70页 |
| CV | 第70-71页 |
| Appendix | 第71-72页 |
