| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-34页 |
| ·PRRS的病原、分类与流行 | 第17-19页 |
| ·PRRSV的致病机理 | 第19-20页 |
| ·PRRSV的基因组结构与复制 | 第20-21页 |
| ·PRRSV的编码蛋白及其功能 | 第21-24页 |
| ·PRRSV非结构蛋白 | 第21-23页 |
| ·PRRSV结构蛋白 | 第23-24页 |
| ·PRRSV遗传变异 | 第24-27页 |
| ·非结构蛋白的变异 | 第24-26页 |
| ·结构蛋白的变异 | 第26页 |
| ·非编码区序列变异 | 第26-27页 |
| ·PRRSV毒力因子 | 第27-29页 |
| ·Nsp2基因变异与PRRSV毒力的关系 | 第27-28页 |
| ·其他毒力相关因子 | 第28-29页 |
| ·PRRSV检测 | 第29-30页 |
| ·病毒分离 | 第29页 |
| ·核酸检测 | 第29页 |
| ·抗原抗体检测 | 第29-30页 |
| ·反向遗传系统在研究PRRSV基因功能及发展新型疫苗和病毒载体上的应用 | 第30-33页 |
| ·研究结构蛋白的功能 | 第30-31页 |
| ·研究非编码区和非结构蛋白的功能 | 第31页 |
| ·在研究新型疫苗和基因载体的上的应用 | 第31-33页 |
| ·研究的目的意义 | 第33-34页 |
| 第二章 PRRSV TJ株和TJM株NSP2基因特性的研究 | 第34-47页 |
| ·材料和方法 | 第34-36页 |
| ·毒株和细胞 | 第34页 |
| ·载体、菌株及试剂 | 第34-35页 |
| ·引物的设计与合成 | 第35页 |
| ·病毒RNA制备 | 第35页 |
| ·RT-PCR反应 | 第35页 |
| ·PCR产物的克隆与鉴定 | 第35-36页 |
| ·序列测定及分析 | 第36页 |
| ·结果 | 第36-44页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第36-37页 |
| ·RT-PCR产物的克隆及鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的测序及比对结果 | 第38-39页 |
| ·缺失的120 aa的蛋白序列结构分析 | 第39-40页 |
| ·PRRSV TJ株F3代和TJM-F92的Nsp2蛋白二级结构预测 | 第40-41页 |
| ·PRRSV TJ株、TJM和VR-2332的Nsp2基因RNA序列结构比较 | 第41-42页 |
| ·鉴别检测TJM与HP-PRRSV | 第42页 |
| ·6对PRRSV强弱毒Nsp2基因氨基酸比对及进化树构建 | 第42-44页 |
| ·结论与讨论 | 第44-47页 |
| 第三章 稳定细胞系的建立及NSP2蛋白对PRRSV复制的影响 | 第47-57页 |
| ·材料和方法 | 第47-49页 |
| ·病毒、细胞、菌种和质粒 | 第47页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·PRRSV TJ株和TJM株Nsp2全基因表达片段的克隆测序 | 第47-48页 |
| ·重组真核表达载体的构建 | 第48页 |
| ·G418最佳工作浓度的确定 | 第48页 |
| ·重组真核表达载体的转染与细胞系的筛选 | 第48页 |
| ·Nsp2在Marc-145细胞系中的表达检测 | 第48-49页 |
| ·细胞生长曲线的绘制 | 第49页 |
| ·PRRSV在细胞系上增殖的测定 | 第49页 |
| ·结果 | 第49-55页 |
| ·PRRSV Nsp2全基因表达片段的克隆 | 第49-50页 |
| ·重组真核表达载体的构建与鉴定 | 第50页 |
| ·G418最佳工作浓度的确定 | 第50-51页 |
| ·表达Nsp2细胞系的筛选 | 第51页 |
| ·PRRSV Nsp2基因在Marc-145细胞中的表达检测 | 第51-54页 |
| ·细胞生长曲线 | 第54页 |
| ·PRRSV在细胞系上的增殖 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| 第四章 用NSP2基因小干扰RNA抑制PRRSV复制的研究 | 第57-67页 |
| ·材料与方法 | 第57-59页 |
| ·病毒、细胞和质粒 | 第57页 |
| ·引物设计与合成 | 第57-59页 |
| ·siRNA的筛选及PRRSV TJ株Nsp2蛋白基因ShRNA表达载体构建 | 第59页 |
| ·shRNA表达载体的转染及病毒的感染 | 第59页 |
| ·半定量RT-PCR检测shRNA表达载体抑制效果 | 第59页 |
| ·shRNA干扰后病毒滴度测定 | 第59页 |
| ·结果 | 第59-65页 |
| ·shRNA的扩增、测序及表达载体的构建 | 第59-60页 |
| ·shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制作用 | 第60-62页 |
| ·半定量RT-PCR检测PRRSV Nsp2 mRNA相对表达量 | 第62-64页 |
| ·病毒滴度测定 | 第64-65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 第五章 高致病性PRRSV强弱毒全长感染性克隆的构建 | 第67-86页 |
| ·材料和方法 | 第67-73页 |
| ·病毒、细胞和质粒 | 第67页 |
| ·试剂 | 第67-68页 |
| ·全长构建策略及引物的设计合成 | 第68页 |
| ·病毒RNA提取及RT-PCR反应获得cDNA片段 | 第68页 |
| ·病毒cDNA的克隆和测序 | 第68页 |
| ·全长cDNA克隆的构建及鉴定 | 第68-69页 |
| ·全长cDNA克隆的转染 | 第69页 |
| ·重组病毒的检测 | 第69-70页 |
| ·病毒多步生长曲线的绘制 | 第70页 |
| ·病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定 | 第70-73页 |
| ·结果 | 第73-83页 |
| ·PRRSV TJ株和TJM株全基因组序列分段扩增及测序结果 | 第73-74页 |
| ·PRRSV TJM株全基因组序列与亲本毒TJ株全序列的比较 | 第74-75页 |
| ·遗传标记的引入 | 第75-76页 |
| ·全长cDNA克隆获得 | 第76-77页 |
| ·PRRSV全长cDNA序列的测序结果 | 第77-78页 |
| ·全基因比对 | 第78-79页 |
| ·重组PRRSV的拯救 | 第79页 |
| ·重组PRRSV的鉴定 | 第79-81页 |
| ·重组病毒生长动力学 | 第81-83页 |
| ·讨论 | 第83-86页 |
| 第六章 全文结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-100页 |
| 附录 | 第100-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 作者简历 | 第108-110页 |
