| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-11页 |
| 1 前言 | 第11-40页 |
| 1．1 研究的目的和意义 | 第11页 |
| 1．2 文献综述 | 第11-39页 |
| 1．2．1 植物水孔蛋白研究进展 | 第11-29页 |
| 1．2．1．1 水孔蛋白的发现 | 第11-14页 |
| 1．2．1．2 水孔蛋白的结构 | 第14-15页 |
| 1．2．1．3 植物水孔蛋白的分类 | 第15-18页 |
| 1．2．1．4 水孔蛋白在植物中的存在部位 | 第18-20页 |
| 1．2．1．5 植物水孔蛋白的活性调控 | 第20-24页 |
| 1．2．1．6 植物水孔蛋白的分子生物学研究 | 第24-26页 |
| 1．2．1．7 水孔蛋白的生理功能 | 第26-29页 |
| 1．2．1．8 结束语 | 第29页 |
| 1．2．2 基于PCR的克隆与己知序列相邻的侧翼序列的染色体步行技术 | 第29-39页 |
| 1．2．2．1 基于PCR的染色体步行技术 | 第30-37页 |
| 1．2．2．1．1 反向PCR技术 | 第30页 |
| 1．2．2．1．2 cDNA末端快速扩增法 | 第30-33页 |
| 1．2．2．1．3 Panhandle PCR | 第33-34页 |
| 1．2．2．1．4 单引物介导PCR的染色体步行技术 | 第34页 |
| 1．2．2．1．5 利用随机引物进行的染色体步行技术 | 第34页 |
| 1．2．2．1．6 RAGE技术 | 第34-36页 |
| 1．2．2．1．7 连接介导PCR的染色体步行 | 第36-37页 |
| 1．2．2．2 提高染色体步行中PCR效率的策略 | 第37-39页 |
| 1．2．2．2．1 混合型DNA聚合酶的应用 | 第37页 |
| 1．2．2．2．2 热启动PCR的应用 | 第37-38页 |
| 1．2．2．2．3 降落PCR的应用 | 第38页 |
| 1．2．2．2．4 两步PCR的应用 | 第38页 |
| 1．2．2．2．5 抑制PCR的应用 | 第38-39页 |
| 1．3 本论文拟解决的问题 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-60页 |
| 2．1 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因的克隆及其在烟草中的正义和反义表达 | 第40-53页 |
| 2．1．1 实验材料 | 第40-41页 |
| 2．1．1．1 植物材料 | 第40页 |
| 2．1．1．2 菌种和质粒 | 第40页 |
| 2．1．1．3 分子生物学及生化试剂 | 第40页 |
| 2．1．1．4 RT-PCR法从油菜total RNA中扩增BnPIPl基因的引物 | 第40-41页 |
| 2．1．1．5 培养基 | 第41页 |
| 2．1．2 实验方法 | 第41-53页 |
| 2．1．2．1 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因的克隆 | 第41-43页 |
| 2．1．2．1．1 油菜总RNA的制备 | 第41-42页 |
| 2．1．2．1．2 RNA样品中DNA污染的去除 | 第42页 |
| 2．1．2．1．3 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因的RT-PCR | 第42-43页 |
| 2．1．2．2 植物双元表达载体的构建 | 第43-46页 |
| 2．1．2．2．1 BnPIPlPCR扩增产物的克隆 | 第43页 |
| 2．1．2．2．2 BnPIPl正义及反义双元表达载体的构建 | 第43-46页 |
| 2．1．2．3 农杆菌介导的烟草遗传转化 | 第46-48页 |
| 2．1．2．3．1 农杆菌LBA4404感受态的制备 | 第46-47页 |
| 2．1．2．3．2 农杆菌LBA4404的转化-冻融法 | 第47页 |
| 2．1．2．3．3 烟草叶盘法转化及再生 | 第47-48页 |
| 2．1．2．4 烟草再生植株的鉴定 | 第48-51页 |
| 2．1．2．4．1 植物基因组DNA的制备 | 第48页 |
| 2．1．2．4．2 TRlzol法制备烟草植株总RNA | 第48页 |
| 2．1．2．4．3 转基因再生植株的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 2．1．2．4．4 转基因再生植株的Southern鉴定 | 第49-50页 |
| 2．1．2．4．5 转基因再生植株的RT-PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 2．1．2．5 油菜BnPIPl基因的功能检测 | 第51-53页 |
| 2．1．2．5．1 转基因阳性株叶肉原生质体的分离与低渗处理 | 第51-52页 |
| 2．1．2．5．2 转基因阳性株的整株干旱性试验 | 第52页 |
| 2．1．2．5．3 转基因阳性株T_0代种子的萌发实验 | 第52-53页 |
| 2．2 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因上游调控区的染色体步行及功能分析 | 第53-60页 |
| 2．2．1 实验材料 | 第53-55页 |
| 2．2．1．1 植物材料 | 第53页 |
| 2．2．1．2 菌种和质粒 | 第53页 |
| 2．2．1．3 分子生物学和生化试剂 | 第53页 |
| 2．2．1．4 寡聚核苷酸序列 | 第53-55页 |
| 2．2．1．4．1 BnPIPl上游调控区的染色体步行的接头序列 | 第53-54页 |
| 2．2．1．4．2 接头引物 | 第54页 |
| 2．2．1．4．3 BnPIPl基因特异性引物 | 第54页 |
| 2．2．1．4．4 测通上游调控区的内部引物 | 第54页 |
| 2．2．1．4．5 获得上游调控区全长片断的引物 | 第54页 |
| 2．2．1．4．6 上游调控区5’端不同长度缺失片断的引物 | 第54-55页 |
| 2．2．1．5 X-Gluc染色液的配制 | 第55页 |
| 2．2．1．6 烟草及细菌培养基 | 第55页 |
| 2．2．2 实验方法 | 第55-60页 |
| 2．2．2．1 BnPIPl上游调控区的克隆及测序 | 第55-57页 |
| 2．2．2．1．1 油菜基因组总DNA的提取 | 第55页 |
| 2．2．2．1．2 连接介导的染色体步行 | 第55-57页 |
| 2．2．2．2 BnPIPl上游调控区全长片断与gus融合表达载体的构建 | 第57-58页 |
| 2．2．2．3 全长启动子5’缺失载体的构建 | 第58页 |
| 2．2．2．4 表达载体转化根癌土壤农杆菌 | 第58页 |
| 2．2．2．5 烟草的叶盘法转化及再生 | 第58页 |
| 2．2．2．6 全长启动子指导gus基因表达的活性检测 | 第58-59页 |
| 2．2．2．7 5’缺失载体转化烟草愈伤组织的GUS活性检测 | 第59-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-85页 |
| 3．1 BnPIPl基因的克隆及其在烟草中的正义和反义表达 | 第60-74页 |
| 3．1．1 BnPIP1基因的获得及序列分析 | 第60-63页 |
| 3．1．2 正义及反义双元表达载体的构建 | 第63-64页 |
| 3．1．3 烟草的遗传转化及再生 | 第64-65页 |
| 3．1．4 转基因烟草的PCR鉴定 | 第65-66页 |
| 3．1．5 转基因烟草的Southern检测 | 第66-67页 |
| 3．1．6 转基因烟草的RT-PCR检测 | 第67页 |
| 3．1．7 转基因烟草的形态特征 | 第67-69页 |
| 3．1．8 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因的功能分析 | 第69-73页 |
| 3．1．8．1 转基因阳性株叶肉原生质体的低渗处理 | 第69-70页 |
| 3．1．8．2 转基因阳性株的整株干旱性试验 | 第70-71页 |
| 3．1．8．3 转基因阳性株T_0代种子的萌发实验 | 第71-73页 |
| 3．1．9 转基因阳性株后代转基因的分离比 | 第73-74页 |
| 3．2 油菜质膜水孔蛋白BnPIPl基因上游调控区的染色体步行 | 第74-85页 |
| 3．2．1 BnPIPl基因上游调控区的克隆及序列分析 | 第74-77页 |
| 3．2．2 BnPIPl基因上游调控区的启动子活性分析 | 第77-80页 |
| 3．2．2．1 gus融合表达载体的构建及对烟草的转化 | 第77-79页 |
| 3．2．2．2 转化烟草再生小芽的GUS活性检测 | 第79-80页 |
| 3．2．3 BnPIPl基因上游调控区的启动子元件的初步分析 | 第80-85页 |
| 3．2．3．1 BnPIPl上游调控区5’缺失载体的构建及对烟草的转化 | 第80-81页 |
| 3．2．3．2 5’缺失载体转化烟草愈伤组织的GUS活性检测 | 第81-83页 |
| 3．2．3．3 5’缺失载体转化烟草的PCR鉴定 | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-93页 |
| 4．1 水孔蛋白与植物抗旱性的关系 | 第85-86页 |
| 4．2 试验设计与鉴定方法的选择 | 第86-88页 |
| 4．3 BnPIPl基因在转基因烟草中的表达状况 | 第88-89页 |
| 4．4 转基因烟草的表性特征 | 第89-90页 |
| 4．5 连接介导PCR的染色体步行技术 | 第90页 |
| 4．6 BnPIPl基因上游调控区的序列特征 | 第90-91页 |
| 4．7 BnPIPl基因上游调控区的启动子活性分析 | 第91-93页 |
| 5 结论 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-112页 |
| 附录 | 第112-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
