| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-12页 |
| 前言 | 第12-39页 |
| 1 鱼类的细菌性疾病 | 第12-13页 |
| 2 鱼类病原鳗弧菌 | 第13-19页 |
| ·流行病学 | 第13-14页 |
| ·致病机制与毒力决定因子 | 第14-19页 |
| ·病原菌对宿主的粘附作用 | 第14-15页 |
| ·毒力质粒及铁吸收系统 | 第15-16页 |
| ·溶血素 | 第16-18页 |
| ·脂多糖 | 第18页 |
| ·外膜蛋白 | 第18-19页 |
| 3 弧菌胞外蛋白酶及其作用 | 第19-23页 |
| ·胞外蛋白酶的种类和理化性质 | 第19-20页 |
| ·弧菌胞外蛋白酶的基因结构及特点 | 第20-22页 |
| ·弧菌胞外蛋白酶的体内作用机制 | 第22-23页 |
| 4 基因体外定点突变技术 | 第23-28页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变 | 第23-25页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤 | 第23-24页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变的改进 | 第24-25页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变法的应用 | 第25页 |
| ·PCR 介导的定点突变法及其改进——大引物突变法 | 第25-26页 |
| ·盒式突变 | 第26-27页 |
| ·三种方法的有缺点比较 | 第27-28页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变法 | 第27页 |
| ·PCR 介导的定点突变法 | 第27页 |
| ·盒式突变 | 第27页 |
| ·合理选择符合研究需要的方法 | 第27-28页 |
| 5 鱼类DNA 疫苗的研究进展 | 第28-37页 |
| ·质粒的构建 | 第29-32页 |
| ·启动子的选择 | 第29-30页 |
| ·抗原基因 | 第30-31页 |
| ·免疫刺激因子 | 第31-32页 |
| ·鱼类DNA 疫苗的接种方法 | 第32-34页 |
| ·注射 | 第32-33页 |
| ·口服和浸泡 | 第33-34页 |
| ·外源基因在鱼体内表达的检测 | 第34-35页 |
| ·DNA 疫苗的免疫效果 | 第35-36页 |
| ·DNA 疫苗可能的免疫机制 | 第36页 |
| ·鱼类DNA 疫苗存在的问题 | 第36-37页 |
| 6 本论文研究的目的和意义 | 第37-39页 |
| 一 材料与方法 | 第39-70页 |
| ·菌株和质粒 | 第39-41页 |
| ·实验动物 | 第41页 |
| ·细胞系 | 第41页 |
| ·培养基 | 第41-43页 |
| ·试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·仪器 | 第43-44页 |
| ·鳗弧菌金属蛋白酶基因empA 的原核表达 | 第44-52页 |
| ·原核表达质粒的构建及鉴定 | 第44-49页 |
| ·金属蛋白酶基因empA 在大肠杆菌中的表达 | 第49-52页 |
| ·重组EmpA 金属蛋白酶的纯化 | 第52-54页 |
| ·重组菌BL21(DE3)/pET24d(+)/empA 的诱导及培养 | 第52-53页 |
| ·从菌体中纯化EmpA 金属蛋白酶 | 第53页 |
| ·从培养上清液中纯化EmpA 金属蛋白酶 | 第53页 |
| ·Ni 琼脂糖亲合柱柱亲和层析 | 第53页 |
| ·Ni 琼脂糖亲和柱的处理与再生 | 第53-54页 |
| ·重组EmpA 金属蛋白酶的性质研究 | 第54-55页 |
| ·菌体中和分泌到上清液中的EmpA 金属蛋白酶的分子量测定 | 第54-55页 |
| ·菌体中和分泌到上清液中的EmpA 金属蛋白酶的蛋白水解活力测定 | 第55页 |
| ·重组EmpA 金属蛋白酶的细胞毒性及致病性 | 第55-56页 |
| ·EmpA 金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系（FG）的细胞毒性 | 第55-56页 |
| ·EmpA 金属蛋白酶对大菱鲆的致病性 | 第56页 |
| ·PCR 定点突变研究金属蛋白酶EmpA 的活性位点 | 第56-61页 |
| ·以pET24d(+)/empA 质粒为模板的定点突变 | 第56-60页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empAs 在大肠杆菌中的表达 | 第60页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empAs 的纯化 | 第60-61页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empA7 的真核表达 | 第61-65页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 在牙鲆体内的表达及表达产物的检测 | 第65-67页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 的大量提取 | 第66页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第66页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第66页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 在牙鲆体内表达产物的检测 | 第66-67页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 对牙鲆免疫效果的研究 | 第67-70页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 的大量提取 | 第67-68页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第68页 |
| ·实验动物处理及免疫 | 第68页 |
| ·免疫牙鲆血清中抗体水平测定 | 第68-69页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 对牙鲆的免疫效果 | 第69-70页 |
| 二 结果与分析 | 第70-104页 |
| ·金属蛋白酶基因empA 在大肠杆菌中的表达 | 第70-77页 |
| ·原核表达质粒的构建及鉴定 | 第70-71页 |
| ·金属蛋白酶基因empA 在大肠杆菌中的表达 | 第71-73页 |
| ·表达条件的优化 | 第73-76页 |
| ·重组菌表达产物的蛋白水解活性测定 | 第76-77页 |
| ·重组EmpA 金属蛋白酶的纯化 | 第77-81页 |
| ·从菌体中纯化重组EmpA 金属蛋白酶 | 第77-80页 |
| ·从培养上清液中纯化重组EmpA 金属蛋白酶 | 第80页 |
| ·菌体中和分泌到培养上清液中EmpA 金属蛋白酶分子量的测定 | 第80-81页 |
| ·重组EmpA 金属蛋白酶的细胞毒性及致病性 | 第81-84页 |
| ·EmpA 金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系（FG）的细胞毒性 | 第81-82页 |
| ·EmpA 金属蛋白酶对牙鲆的致病性 | 第82-84页 |
| ·PCR 定点突变研究金属蛋白酶EmpA 的活性位点 | 第84-89页 |
| ·以pET24d(+)/empA 质粒为模板的定点突变 | 第84页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empAs 在大肠杆菌中的表达 | 第84-85页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empAs 的纯化 | 第85-87页 |
| ·突变对EmpA 金属蛋白酶蛋白水解活性的影响 | 第87-88页 |
| ·突变对EmpA 金属蛋白酶细胞毒性的影响 | 第88-89页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empA7 在真核细胞中的表达 | 第89-94页 |
| ·pEGFP-N1/m-empA7 真核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第89-90页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第90页 |
| ·pEGFP-N1/m-empA7 真核重组表达质粒在真核细胞中的表达 | 第90-94页 |
| ·突变的金属蛋白酶基因m-empA7 在牙鲆体内的表达 | 第94-101页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第94页 |
| ·pEGFP-N1/m-empA7 真核重组表达质粒在牙鲆体内的表达 | 第94-101页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 对牙鲆的免疫效果 | 第101-104页 |
| ·提取的重组质粒的浓度和纯度检测 | 第101页 |
| ·免疫牙鲆血清中特异性抗体水平的变化 | 第101-102页 |
| ·真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7 对牙鲆的免疫效果 | 第102-104页 |
| 三 讨论 | 第104-118页 |
| ·鳗弧菌 W-1 金属蛋白酶 EmpA 在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究 | 第104-109页 |
| ·PCR 定点突变研究鳗弧菌金属蛋白酶基因 empA 的活性位点 | 第109-113页 |
| ·真核重组表达质粒 pEGFP-N1/m-empA7 在真核细胞中的表达 | 第113-114页 |
| ·真核重组表达质粒 pEGFP-N1/m-empA7 在牙鲆体内的表达 | 第114页 |
| ·真核重组表达质粒 pEGFP-N1/m-empA7 对牙鲆的免疫保护效果 | 第114-118页 |
| 四 结论 | 第118-120页 |
| 参考文献 | 第120-135页 |
| 附录I 溶液配方 | 第135-138页 |
| 附录II 发表和撰写的文章 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139页 |
