| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-13页 |
| 前言 | 第13-25页 |
| 一、造血干细胞介导的基因治疗载体概况 | 第13-16页 |
| 二、新型人源打靶载体 | 第16-19页 |
| 三、β-地中海贫血基因治疗研究中载体的应用 | 第19-25页 |
| 材料与方法 | 第25-43页 |
| 一、实验材料 | 第25-26页 |
| 1.菌株和质粒 | 第25页 |
| 2.细胞系 | 第25页 |
| 3.限制性内切酶及修饰酶 | 第25页 |
| 4.放射性核素 | 第25页 |
| 5.其它主要试剂 | 第25-26页 |
| 6.主要仪器 | 第26页 |
| 二、实验方法 | 第26-43页 |
| 1.人源打靶载体介导的人~Aγ-珠蛋白基因转移的基本路线 | 第26-35页 |
| ·EHγ重组体构建的总体策略 | 第26-31页 |
| ·基因座控制区DNaseⅠ高敏位点的选择 | 第26-27页 |
| ·结构基因的选择 | 第27-28页 |
| ·EHγ重组体构建路线 | 第28-31页 |
| ·聚乙二醇(PEG)法回收DNA片段 | 第31页 |
| ·试剂盒回收DNA片段 | 第31页 |
| ·DNA片段3’端凹陷的补平 | 第31页 |
| ·DNA片段3’端突出的削平 | 第31页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第31-32页 |
| ·连接反应 | 第32页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第32页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第32-33页 |
| ·感受态细胞的快速转化 | 第33页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第33页 |
| ·重组体的鉴定 | 第33页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第33-34页 |
| ·无内毒素质粒DNA的大量制备 | 第34页 |
| ·PCR引物及反应条件 | 第34-35页 |
| 2.K562细胞传代及培养 | 第35-36页 |
| ·细胞复苏 | 第35页 |
| ·细胞培养 | 第35页 |
| ·细胞的传代及冻存 | 第35页 |
| ·G418及GCV溶液配制 | 第35-36页 |
| ·联苯胺染色试剂配制 | 第36页 |
| 3.人源打靶载体转染K562细胞及细胞筛选 | 第36-37页 |
| ·人源打靶载体转染K562细胞 | 第36-37页 |
| ·Lipofectamine-2000法转染悬浮细胞 | 第36页 |
| ·电穿孔法转染DNA | 第36-37页 |
| ·正负筛选获得~Aγ-珠蛋白基因定向整合的K562细胞单克隆 | 第37页 |
| 4.转染细胞的DNA结构分析 | 第37-39页 |
| ·从转染细胞中提取基因组DNA | 第37页 |
| ·基因组DNA的PCR分析 | 第37页 |
| ·基因组DNA的Southern印迹分析 | 第37-39页 |
| ·酶解 | 第38页 |
| ·电泳 | 第38页 |
| ·Southern转移 | 第38页 |
| ·DNA探针标记 | 第38-39页 |
| ·预杂交及杂交 | 第39页 |
| ·洗膜及放射自显影 | 第39页 |
| 5.FISH定位~Aγ-珠蛋白基因整合位点 | 第39页 |
| 6.RNase保护实验检测人~Aγ-珠蛋白基因的表达水平 | 第39-43页 |
| ·Hemin诱导K562细胞分化 | 第39页 |
| ·从诱导前及诱导后K562细胞中提取细胞总RNA | 第39-40页 |
| ·RNase保护实验 | 第40-43页 |
| ·RNA探针标记 | 第40页 |
| ·RNA探针纯化 | 第40-41页 |
| ·RNA：RNA杂交及RNase反应 | 第41-42页 |
| ·变性胶电泳及放射自显影 | 第42-43页 |
| 实验结果 | 第43-55页 |
| 一、携带人~Aγ-珠蛋白基因的人源打靶载体重组体的构建 | 第43-46页 |
| 1.重组体BACE的构建 | 第43页 |
| 2.重组体pBSKHS432的构建 | 第43-44页 |
| 3.重组体pBSKHS432~Aγ的构建 | 第44页 |
| 4.重组体EHγ的构建 | 第44-46页 |
| 二、流式细胞仪分析K562细胞转染效率 | 第46-48页 |
| 三、EHγ重组体在K562细胞中的整合分析 | 第48-50页 |
| 1.基因组DNA的PCR分析 | 第48页 |
| 2.基因组DNA的Southern分析 | 第48-50页 |
| 四.FISH鉴定DNA整合位点 | 第50页 |
| 五.稳定整合克隆中~Aγ-珠蛋白基因表达分析 | 第50-55页 |
| 讨论 | 第55-63页 |
| 一、BACMS打靶载体及特点 | 第55-56页 |
| 二、EHγ重组体的构建 | 第56-57页 |
| 三、EHγ重组体在K562细胞中的转染及打靶效率分析 | 第57-59页 |
| 四、EHγ重组体在K562细胞中的整合与打靶位点分析 | 第59-60页 |
| 五、稳定整合K562细胞克隆中~Aγ-珠蛋白基因表达分析 | 第60-61页 |
| 六、新型人源打靶载体的意义及应用前景 | 第61-63页 |
| 小结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-73页 |
| 文献综述 | 第73-89页 |
| 英文名词及缩写 | 第89-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 个人简历 | 第93页 |
