| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1 银耳概述 | 第14-18页 |
| 1.1 银耳简介 | 第14页 |
| 1.2 银耳的营养价值 | 第14-15页 |
| 1.2.1 营养价值 | 第14-15页 |
| 1.2.2 药用价值 | 第15页 |
| 1.2.3 经济价值 | 第15页 |
| 1.3 银耳的生物学特性 | 第15-18页 |
| 1.3.1 生长习性 | 第15-16页 |
| 1.3.2 形态结构 | 第16页 |
| 1.3.3 生活史 | 第16-17页 |
| 1.3.4 银耳芽孢作为外源基因表达宿主的优点 | 第17-18页 |
| 2 外源基因在真核微生物中的表达量优化策略 | 第18-27页 |
| 2.1 DNA水平的调控 | 第18-23页 |
| 2.1.1 DNA的修饰 | 第18-22页 |
| 2.1.2 染色质效应 | 第22页 |
| 2.1.3 基因的重排与扩增 | 第22页 |
| 2.1.4 表达框的染色体整合位点和方式 | 第22-23页 |
| 2.2 转录水平的调控 | 第23-24页 |
| 2.2.1 启动子的选择 | 第23页 |
| 2.2.2 增强子 | 第23页 |
| 2.2.3 终止子 | 第23-24页 |
| 2.2.4 MARs序列 | 第24页 |
| 2.2.5 内含子 | 第24页 |
| 2.3 翻译水平的调控 | 第24-27页 |
| 2.3.1 密码子优化 | 第24-25页 |
| 2.3.2 翻译相关因子的作用 | 第25页 |
| 2.3.3 提高表达蛋白的稳定性 | 第25-26页 |
| 2.3.4 培养条件的优化 | 第26-27页 |
| 3 银耳生物反应器的研究现状 | 第27-28页 |
| 4 Laccase基因研究现状 | 第28-29页 |
| 5 survivin (T34A)基因的研究现状 | 第29-30页 |
| 6 本课题研究的目的和意义 | 第30-31页 |
| 第二章 不同真核生物系列表达载体的构建及鉴定 | 第31-63页 |
| 1 材料与方法 | 第31-47页 |
| 1.1 材料 | 第31-35页 |
| 1.1.1 供试菌株与质粒 | 第31页 |
| 1.1.2 试剂 | 第31-32页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第32-33页 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 | 第33-34页 |
| 1.1.5 PCR引物 | 第34-35页 |
| 1.2 方法 | 第35-47页 |
| 1.2.1 菌株的活化 | 第35-36页 |
| 1.2.2 质粒的提取 | 第36页 |
| 1.2.3 pTE11-rfp表达载体的构建 | 第36-40页 |
| 1.2.4 pTE11-lacZ基因表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 1.2.5 pTE11-Laccase基因表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 1.2.6 pCAMBIA1301-survivin (T34A)和pCAMBIA1301-s-survivin (T34A)表达载体的构建 | 第43-45页 |
| 1.2.7 pCAMBIA1301-co-survivin (T34A)表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 1.2.8 pTE11-survivin (T34A)、pTE11-co-survivin (T34A)表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 2 结果分析 | 第47-60页 |
| 2.1 重组质粒pTE11-rfp的鉴定 | 第47-49页 |
| 2.1.1 菌落PCR鉴定 | 第47页 |
| 2.1.2 重组质粒鉴定 | 第47-48页 |
| 2.1.3 酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 2.1.4 测序鉴定和BLAST分析 | 第49页 |
| 2.2 重组质粒pTE11-lacZ的鉴定 | 第49-51页 |
| 2.2.1 菌落PCR鉴定 | 第49页 |
| 2.2.2 重组质粒鉴定 | 第49-50页 |
| 2.2.3 酶切鉴定 | 第50页 |
| 2.2.4 测序鉴定和BLAST分析 | 第50-51页 |
| 2.2.5 表达鉴定 | 第51页 |
| 2.3 重组质粒pTE11-Laccase的鉴定 | 第51-53页 |
| 2.3.1 菌落PCR鉴定 | 第51-52页 |
| 2.3.2 重组质粒鉴定 | 第52页 |
| 2.3.3 酶切鉴定 | 第52-53页 |
| 2.3.4 测序鉴定 | 第53页 |
| 2.4 重组质粒pCAMBIA1301-survivin (T34A)和pCAMBIA1301-s-survivin (T34A)的鉴定 | 第53-55页 |
| 2.4.1 菌落PCR鉴定 | 第53-54页 |
| 2.4.2 重组质粒鉴定 | 第54页 |
| 2.4.3 酶切鉴定 | 第54-55页 |
| 2.4.4 测序鉴定 | 第55页 |
| 2.5 重组质粒pCAMBIA1301-co-survivin (T34A)的鉴定 | 第55-57页 |
| 2.5.1 co-survivin(T34A)基因的优化结果 | 第55-56页 |
| 2.5.2 菌落PCR鉴定 | 第56页 |
| 2.5.3 重组质粒鉴定 | 第56-57页 |
| 2.5.4 酶切鉴定 | 第57页 |
| 2.5.5 测序鉴定 | 第57页 |
| 2.6 重组质粒pTE11-survivin (T34A)、 pTE11-co-survivin (T34A)的鉴定 | 第57-60页 |
| 2.6.1 菌落PCR鉴定 | 第57-58页 |
| 2.6.2 重组质粒鉴定 | 第58-59页 |
| 2.6.3 酶切鉴定 | 第59页 |
| 2.6.4 测序鉴定 | 第59-60页 |
| 3 小结与讨论 | 第60-63页 |
| 第三章 银耳芽孢的遗传转化及表达鉴定 | 第63-81页 |
| 1 材料与方法 | 第63-71页 |
| 1.1 材料 | 第63-67页 |
| 1.1.1 供试菌株与质粒 | 第63页 |
| 1.1.2 试剂 | 第63-64页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第64页 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 | 第64-66页 |
| 1.1.5 PCR引物 | 第66-67页 |
| 1.2 方法 | 第67-71页 |
| 1.2.1 银耳芽孢的培养 | 第67页 |
| 1.2.2 银耳芽孢的预处理 | 第67页 |
| 1.2.3 银耳芽孢原生质体的制备 | 第67页 |
| 1.2.4 PEG介导转化银耳芽孢 | 第67页 |
| 1.2.5 银耳芽孢转化子的筛选 | 第67-68页 |
| 1.2.6 银耳芽孢转化子的分子鉴定 | 第68-69页 |
| 1.2.7 银耳芽孢转化子的表达鉴定 | 第69-71页 |
| 2 结果 | 第71-80页 |
| 2.1 基因组DNA的提取结果 | 第71页 |
| 2.2 银耳芽孢转化子的分子检测 | 第71-78页 |
| 2.2.1 rfp基因的PCR检测 | 第71-72页 |
| 2.2.2 lacZ基因的PCR检测 | 第72-73页 |
| 2.2.3 Laccase基因的PCR检测 | 第73-74页 |
| 2.2.4 pCAMBIA1301-survivin (T34A) 、pCAMBIA1301-s-survivin (T34A) 和pCAMBIA1301-co-survivin (T34A)的PCR检测 | 第74-76页 |
| 2.2.5 pTE11-survivin (T34A)pTE11-co-survivin (T34A)的PCR检测 | 第76-78页 |
| 2.2.6 测序鉴定结果 | 第78页 |
| 2.3 转化子的表达鉴定 | 第78-80页 |
| 2.3.1 rfp的荧光观察 | 第78页 |
| 2.3.2 β-半乳糖苷酶表达结果 | 第78-80页 |
| 2.3.3 定量检测胞外漆酶活性结果 | 第80页 |
| 3 小结与讨论 | 第80-81页 |
| 第四章 银耳芽孢细胞膜通透性调控研究 | 第81-95页 |
| 1 材料与方法 | 第81-84页 |
| 1.1 材料 | 第81-82页 |
| 1.1.1 供试菌株 | 第81页 |
| 1.1.2 试剂 | 第81页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第81页 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 | 第81-82页 |
| 1.2 方法 | 第82-84页 |
| 1.2.1 种子培养 | 第82页 |
| 1.2.2 二级培养 | 第82页 |
| 1.2.3 制作吸光值-银耳芽孢个数的标准曲线 | 第82页 |
| 1.2.4 银耳芽孢生长曲线的测定 | 第82-83页 |
| 1.2.5 发酵液的处理 | 第83页 |
| 1.2.6 分析方法 | 第83-84页 |
| 2 结果 | 第84-93页 |
| 2.1 吸光值-银耳芽孢个数标准曲线 | 第84页 |
| 2.2 银耳芽孢生长曲线 | 第84-85页 |
| 2.3 有机溶剂对银耳芽孢细胞膜通透性的影响 | 第85-87页 |
| 2.4 表面活性物质对银耳芽孢细胞膜通透性的影响 | 第87-89页 |
| 2.5 膜表面作用抗生素对银耳芽孢细胞膜通透性的影响 | 第89-91页 |
| 2.6 无机盐类物质对银耳芽孢细胞膜通透性的影响 | 第91-93页 |
| 3 小结与讨论 | 第93-95页 |
| 第五章 总结与展望 | 第95-98页 |
| 1 论文总结 | 第95-96页 |
| 2 展望 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-106页 |
| 缩略语表 | 第106-107页 |
| 附录1 目的基因原始序列及密码子优化后序列 | 第107-110页 |
| 附录2 相关载体图谱 | 第110-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
