| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-19页 |
| 1.1 羧肽酶概述 | 第9页 |
| 1.2 羧肽酶Y概述 | 第9-11页 |
| 1.2.1 羧肽酶Y酶原的体内加工与激活 | 第9-10页 |
| 1.2.2 羧肽酶Y的研究进展 | 第10页 |
| 1.2.3 羧肽酶Y的应用 | 第10-11页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第11-14页 |
| 1.3.1 毕赤酵母甲醇代谢途径 | 第11-12页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达宿主菌 | 第12-13页 |
| 1.3.3 外源基因的转化及整合到毕赤酵母基因组 | 第13-14页 |
| 1.4 影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素 | 第14-18页 |
| 1.4.1 表达启动子的选择 | 第14-15页 |
| 1.4.2 外源基因拷贝数的影响 | 第15-16页 |
| 1.4.3 外源基因的特性 | 第16页 |
| 1.4.4 表达条件 | 第16页 |
| 1.4.5 内源性蛋白酶 | 第16页 |
| 1.4.6 毕赤酵母分泌途径的修饰 | 第16-18页 |
| 1.5 本论文研究的意义及内容 | 第18-19页 |
| 1.5.1 本文研究的意义 | 第18页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第18-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-29页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 质粒、菌种与引物 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 | 第19-20页 |
| 2.1.3 培养基 | 第20页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第20-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-23页 |
| 2.2.1 质粒DNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.2 PCR产物纯化 | 第22页 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第22页 |
| 2.2.4 大肠杆菌转化 | 第22页 |
| 2.2.5 线性化质粒浓缩 | 第22-23页 |
| 2.2.6 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.2.7 毕赤酵母转化 | 第23页 |
| 2.3 表达重组菌pPICZα-proCPY/GS115的构建、筛选及表达 | 第23-25页 |
| 2.3.1 重组质粒pPICZα-proCPY的构建 | 第23-24页 |
| 2.3.2 重组菌pPICZα-proCPY/GS115的构建 | 第24-25页 |
| 2.3.3 重组菌pPICZα-proCPY/GS115的筛选 | 第25页 |
| 2.3.4 重组菌株pPICZα-proCPY/GS115的表达 | 第25页 |
| 2.3.5 重组菌株pPICZα-proCPY/GS115表达结果分析 | 第25页 |
| 2.4 重组菌pGAPZα-proCPY/GS115的构建、筛选及表达 | 第25-26页 |
| 2.4.1 重组菌pGAPZα-proCPY/GS115的构建及高拷贝菌株筛选 | 第25-26页 |
| 2.4.2 重组菌pGAPZα-proCPY/GS115的表达 | 第26页 |
| 2.5 双质粒整合菌株构建、筛选及表达 | 第26-27页 |
| 2.5.1 双质粒整合菌株Zα-600+9K/GS115的构建、筛选及表达 | 第26页 |
| 2.5.2 双质粒整合菌株Zα-600-1+GAP/GS115的构建、筛选及表达 | 第26-27页 |
| 2.6 毕赤酵母分泌途径修饰表达重组菌株的构建、筛选及表达 | 第27-28页 |
| 2.6.1 共表达菌株构建及筛选 | 第27-28页 |
| 2.6.2 共表达菌株的表达 | 第28页 |
| 2.7 羧肽酶Y酶原纯化 | 第28页 |
| 2.8 羧肽酶Y酶原体外激活及酶活检测 | 第28-29页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第29-43页 |
| 3.1 pPICZα-proCPY/GS115高效重组菌株筛选 | 第29-31页 |
| 3.1.1 pPICZα-proCPY表达重组质粒的构建 | 第29页 |
| 3.1.2 高拷贝重组菌株pPICZα-proCPY/GS115的构建、筛选及表达 | 第29-30页 |
| 3.1.3 诱导时间优化 | 第30-31页 |
| 3.2 pGAPZα-proCPY/GS115高效重组菌株筛选 | 第31-33页 |
| 3.2.1 表达载体pGAPZα-proCPY的构建 | 第31-32页 |
| 3.2.2 高表达重组菌株pGAPZα-proCPY/GS115的筛选 | 第32-33页 |
| 3.3 双质粒整合菌株的构建、筛选与表达 | 第33-37页 |
| 3.3.1 双质粒整合菌株Zα-600-1-9K/GS115的构建、筛选及表达 | 第33-35页 |
| 3.3.2 双质粒整合菌株Zα-600-1-GAP/GS115的构建、筛选与表达 | 第35-37页 |
| 3.4 毕赤酵母分泌途径修饰 | 第37-41页 |
| 3.4.1 共表达BIP重组菌株的构建及筛选 | 第37-39页 |
| 3.4.2 共表达PDI重组菌株的构建及筛选 | 第39-40页 |
| 3.4.3 共表达ERO1重组菌株的构建及筛选 | 第40-41页 |
| 3.5 羧肽酶Y酶原纯化、体外激活及酶活检测 | 第41-43页 |
| 主要结论及展望 | 第43-44页 |
| 主要结论 | 第43页 |
| 展望 | 第43-44页 |
| 致谢 | 第44-46页 |
| 参考文献 | 第46-51页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第51页 |
