| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第13-17页 |
| 1.1 白介素22(IL-22)及其受体系统 | 第13-15页 |
| 1.1.1 IL-22概述 | 第13-14页 |
| 1.1.2 IL-22受体(IL-22R)系统概述 | 第14-15页 |
| 1.2 硬骨鱼中IL-22及IL-22R的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.2.1 硬骨鱼中IL-22研究现状概述 | 第15页 |
| 1.2.2 硬骨鱼中IL-22R系统研究现状概述 | 第15-16页 |
| 1.3 研究内容和意义 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-28页 |
| 2.1 实验材料 | 第17页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第17页 |
| 2.1.2 实验菌株 | 第17页 |
| 2.1.3 实验质粒 | 第17页 |
| 2.2 实验仪器及设备 | 第17页 |
| 2.3 实验试剂 | 第17-18页 |
| 2.4 溶液配方 | 第18-19页 |
| 2.5 试验方法与操作 | 第19-27页 |
| 2.5.1 草鱼组织RNA的提取及cDNA的制备 | 第19-21页 |
| 2.5.1.1 草鱼总RNA的提取 | 第19-20页 |
| 2.5.1.2 草鱼各组织cDNA的制备 | 第20-21页 |
| 2.5.2 原核表达系统 | 第21页 |
| 2.5.3 蛋白浓度的测定 | 第21-22页 |
| 2.5.4 变复性方法 | 第22页 |
| 2.5.5 草鱼肝细胞的分离 | 第22页 |
| 2.5.6 细胞的收取 | 第22页 |
| 2.5.7 实时荧光定量PCR(qPCR)引物的设计 | 第22-23页 |
| 2.5.8 实时荧光定量PCR | 第23页 |
| 2.5.9 DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.5.10 质粒的酵母转化 | 第24页 |
| 2.5.11 酵母的诱导表达 | 第24页 |
| 2.5.12 重组蛋白的纯化 | 第24-25页 |
| 2.5.13 Westernblotting(WB)实验 | 第25-26页 |
| 2.5.14 抗原抗体预吸附实验 | 第26页 |
| 2.5.15 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第26页 |
| 2.5.16 转染 | 第26-27页 |
| 2.5.17 转染后收取细胞样品 | 第27页 |
| 2.5.18 统计学分析 | 第27页 |
| 2.6 引物列表 | 第27-28页 |
| 第三章 草鱼IL-22的分子克隆及生物信息学分析 | 第28-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第28页 |
| 3.1.1 实验动物、菌株、质粒 | 第28页 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 | 第28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-30页 |
| 3.2.1 草鱼组织RNA的提取及cDNA的制备 | 第28页 |
| 3.2.2 草鱼IL-22编码序列的克隆 | 第28-29页 |
| 3.2.3 草鱼IL-22CDS序列和其他物种的同源分子序列的比对 | 第29-30页 |
| 3.2.4 草鱼IL-22的氨基酸序列 | 第30页 |
| 3.2.5 草鱼IL-22的信号肽预测 | 第30页 |
| 3.2.6 IL-22系统进化树的构建 | 第30页 |
| 3.2.7 草鱼IL-223D模型的构建 | 第30页 |
| 3.3 实验结果 | 第30-35页 |
| 3.3.1 草鱼IL-22的全长CDS序列及其氨基酸序列信息 | 第30-33页 |
| 3.3.2 IL-22系统进化树的构建 | 第33页 |
| 3.3.3 草鱼IL-223D模型的构建 | 第33-35页 |
| 3.4 讨论 | 第35-36页 |
| 第四章 草鱼IL-22的重组表达 | 第36-50页 |
| 4.1 实验材料 | 第36页 |
| 4.1.1 实验动物、菌株、质粒 | 第36页 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 | 第36页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第36页 |
| 4.2 实验方法 | 第36-40页 |
| 4.2.1 草鱼IL-22基因上酶切位点预测 | 第36页 |
| 4.2.2 使用PET30a原核表达系统表达草鱼IL- | 第36-37页 |
| 4.2.2.1 构建草鱼IL-22-PET30a表达载体 | 第36-37页 |
| 4.2.2.2 草鱼IL-22的重组表达 | 第37页 |
| 4.2.2.3 诱导表达样品的SDS-PAGE分析 | 第37页 |
| 4.2.3 PET32a原核表达系统表达草鱼IL- | 第37-38页 |
| 4.2.3.1 构建草鱼IL-22-PET32a表达载体 | 第37页 |
| 4.2.3.2 草鱼重组IL-22的诱导表达 | 第37页 |
| 4.2.3.3 诱导表达样品的SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| 4.2.4 通过变复性方法获得可溶性草鱼IL-22蛋白 | 第38-39页 |
| 4.2.4.1 建立变复性方法 | 第38页 |
| 4.2.4.2 使用变复性方法处理IL-22-PET30a菌株重组表达的包涵体蛋白 | 第38页 |
| 4.2.4.3 IL-22蛋白的生物活性的验证 | 第38页 |
| 4.2.4.4 使用变复性方法处理IL-22-PET32a菌株重组表达的包涵体蛋白 | 第38-39页 |
| 4.2.4.5 IL-22蛋白的生物活性验证 | 第39页 |
| 4.2.5 毕赤酵母真核表达系统重组表达草鱼IL-22蛋白 | 第39-40页 |
| 4.2.5.1 构建IL-22-pPICZαa表达载体 | 第39页 |
| 4.2.5.2 IL-22-pPICZαa质粒的线性化和电转化 | 第39-40页 |
| 4.2.5.3 IL-22-pPICZαa阳性菌株的筛选和诱导表达 | 第40页 |
| 4.2.5.4 诱导表达小样进行Westernblotting | 第40页 |
| 4.2.5.5 放大表达及纯化分析 | 第40页 |
| 4.2.5.6 酵母重组表达IL-22蛋白的生物活性验证 | 第40页 |
| 4.3 实验结果 | 第40-48页 |
| 4.3.1 草鱼IL-22基因上酶切位点预测 | 第40-41页 |
| 4.3.2 PET30a原核表达系统表达草鱼IL- | 第41-42页 |
| 4.3.2.1 构建IL-22-PET30a表达载体 | 第41-42页 |
| 4.3.2.2 IL-22-PET30a菌株的表达 | 第42页 |
| 4.3.3 PET32a原核表达系统表达草鱼IL- | 第42-44页 |
| 4.3.3.1 构建IL-22-PET32a表达载体 | 第42-43页 |
| 4.3.3.2 IL-22-PET32a菌株的表达 | 第43-44页 |
| 4.3.4 变复性方法获得可溶性草鱼IL-22蛋白 | 第44-46页 |
| 4.3.4.1 变复性方法试剂 | 第44页 |
| 4.3.4.2 变复性处理IL-22-PET30a菌株表达的IL-22包涵体蛋白 | 第44页 |
| 4.3.4.3 变复性处理IL-22-PET30a菌株表达的IL-22包涵体蛋白后的活性验证 | 第44-45页 |
| 4.3.4.4 变复性处理IL-22-PET32a菌株表达的IL-22包涵体蛋白 | 第45-46页 |
| 4.3.4.5 变复性处理IL-22-PET32a菌株表达的IL-22包涵体蛋白后的活性验证 | 第46页 |
| 4.3.5 酵母表达系统获得可溶性草鱼IL-22蛋白 | 第46-48页 |
| 4.3.5.1 构建IL-22-pPICZαa表达载体 | 第46-47页 |
| 4.3.5.2 获得IL-22-pPICZαa阳性酵母表达菌株 | 第47页 |
| 4.3.5.3 重组IL-22蛋白的纯化及活性验证 | 第47-48页 |
| 4.4 讨论 | 第48-50页 |
| 第五章 草鱼IL-22的抗体特异性验证以及草鱼HKLs中IL-22的分泌检测 | 第50-54页 |
| 5.1 实验材料 | 第50页 |
| 5.1.1 实验动物、菌株、质粒 | 第50页 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 | 第50页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第50页 |
| 5.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 5.2.1 草鱼IL-22蛋白定制抗体的特异性验证 | 第50页 |
| 5.2.1.1 草鱼IL-22蛋白抗体的定制 | 第50页 |
| 5.2.1.2 草鱼IL-22蛋白抗体特异性验证 | 第50页 |
| 5.2.1.3 草鱼IL-22蛋白定制抗体建立ELISA | 第50页 |
| 5.2.2 外界刺激对草鱼免疫细胞中IL-22蛋白分泌情况的影响 | 第50-51页 |
| 5.2.2.1 PMA处理草鱼HKLs细胞后对IL-22蛋白分泌的影响 | 第50-51页 |
| 5.3 实验结果 | 第51-52页 |
| 5.3.1 草鱼IL-22蛋白定制抗体的特异性验证 | 第51页 |
| 5.3.2 用草鱼IL-22蛋白定制抗体建立ELISA | 第51-52页 |
| 5.3.3 外界刺激促进草鱼免疫细胞中IL-22蛋白的分泌 | 第52页 |
| 5.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第六章 草鱼IL-22RA1的克隆与过表达 | 第54-61页 |
| 6.1 实验材料 | 第54页 |
| 6.1.1 实验动物、菌株、质粒 | 第54页 |
| 6.1.2 实验仪器与设备 | 第54页 |
| 6.1.3 实验试剂 | 第54页 |
| 6.2 实验方法 | 第54-55页 |
| 6.2.1 草鱼IL-22蛋白膜上受体IL-22RA1的克隆 | 第54-55页 |
| 6.2.1.1 草鱼IL-22RA1的定位 | 第54页 |
| 6.2.1.2 草鱼IL-22RA1的克隆和序列结构分析 | 第54页 |
| 6.2.1.3 草鱼IL-22RA1的组织分布检测 | 第54-55页 |
| 6.2.2 草鱼IL-22RA1在Cos7细胞中的过表达 | 第55页 |
| 6.2.2.1 IL-22RA1-pEGFP-N1表达载体的构建 | 第55页 |
| 6.2.2.2 IL-22RA1-pEGFP-N1表达载体转染Cos7细胞和过表达 | 第55页 |
| 6.3 实验结果 | 第55-60页 |
| 6.3.1 草鱼IL-22RA1的基因定位与克隆 | 第55-59页 |
| 6.3.1.1 草鱼IL-22RA1的基因定位 | 第55-56页 |
| 6.3.1.2 草鱼IL-22RA1的克隆 | 第56-58页 |
| 6.3.1.2 草鱼IL-22RA1的组织分布检测 | 第58-59页 |
| 6.3.2 草鱼IL-22RA1在Cos7细胞中过表达 | 第59-60页 |
| 6.3.2.1 IL-22RA1-pEGFP-N1表达载体的构建 | 第59页 |
| 6.3.2.2 IL-22RA1的过表达 | 第59-60页 |
| 6.4 讨论 | 第60-61页 |
| 第七章 草鱼IL-22胞外结合蛋白的克隆与表达 | 第61-73页 |
| 7.1 实验材料 | 第61页 |
| 7.1.1 实验动物、菌株、质粒 | 第61页 |
| 7.1.2 实验仪器与设备 | 第61页 |
| 7.1.3 实验试剂 | 第61页 |
| 7.2 实验方法 | 第61-63页 |
| 7.2.1 草鱼IL-22胞外结合蛋白的克隆 | 第61-62页 |
| 7.2.1.1 草鱼IL-22胞外结合蛋白的克隆 | 第61页 |
| 7.2.1.2 IL-22BP的系统进化树的构建 | 第61-62页 |
| 7.2.1.3 草鱼IL-22BP组织分布检测 | 第62页 |
| 7.2.2 草鱼IL-22BP的重组表达 | 第62-63页 |
| 7.2.2.1 草鱼IL-22BP-PET30a质粒表达载体的构建 | 第62页 |
| 7.2.2.2 草鱼IL-22BP的重组表达 | 第62页 |
| 7.2.2.3 草鱼IL-22BP-PET32a质粒表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 7.2.2.4 草鱼IL-22BP的重组表达 | 第63页 |
| 7.3 实验结果 | 第63-71页 |
| 7.3.1 草鱼IL-22BP的克隆 | 第63-68页 |
| 7.3.1.1 草鱼IL-22BP的克隆及结构预测 | 第63-65页 |
| 7.3.1.2 草鱼IL-22BP系统进化树的构建 | 第65-67页 |
| 7.3.1.3 草鱼IL-22BP的组织分布检测 | 第67-68页 |
| 7.3.2 草鱼IL-22BP的重组表达 | 第68-71页 |
| 7.3.2.1 构建IL-22BP-PET30a表达载体 | 第68-69页 |
| 7.3.2.2 IL-22BP-PET30a菌株诱导表达IL-22BP | 第69-70页 |
| 7.3.2.3 构建IL-22BP-PET32a表达载体 | 第70页 |
| 7.3.2.4 IL-22-PET32a菌株中IL-22BP的表达 | 第70-71页 |
| 7.3.2.5 变复性处理IL-22BP-PET32a菌株表达的IL-22BP包涵体蛋白 | 第71页 |
| 7.4 讨论 | 第71-73页 |
| 第八章 结论与展望 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 | 第80页 |
