| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-15页 |
| 文献综述 | 第15-34页 |
| 第一章 RNA 干扰技术研究进展 | 第15-26页 |
| ·RNA 干扰技术研究简介 | 第15-19页 |
| ·shRNA | 第16-17页 |
| ·miRNA | 第17-19页 |
| ·iphRNA | 第19页 |
| ·piRNA | 第19页 |
| ·RNA 干扰的分子机制 | 第19-21页 |
| ·转录水平的基因沉默 | 第20页 |
| ·转录后水平的基因沉默 | 第20-21页 |
| ·RNA 干扰的生物学功能 | 第21-22页 |
| ·抗病毒 | 第21-22页 |
| ·抑制转座作用 | 第22页 |
| ·影响基因调控 | 第22页 |
| ·影响生长发育 | 第22页 |
| ·RNA 干扰片段的产生和载体构建 | 第22-24页 |
| ·化学合成法 | 第22-23页 |
| ·体外转录法 | 第23页 |
| ·酶消化法 | 第23页 |
| ·shRNA 表达载体 | 第23页 |
| ·siRNA 表达框架 | 第23-24页 |
| ·RNA 干扰的应用领域 | 第24-25页 |
| ·研究基因功能 | 第24页 |
| ·用于基因治疗 | 第24页 |
| ·用于药物筛选 | 第24页 |
| ·研究信号传导通路 | 第24-25页 |
| ·存在的问题及未来发展趋势 | 第25-26页 |
| 第二章 动物转基因技术研究进展 | 第26-34页 |
| ·常用的动物转基因技术 | 第26-29页 |
| ·显微注射法 | 第26页 |
| ·脂质体转染法 | 第26-27页 |
| ·电穿孔转染法 | 第27页 |
| ·胚胎干细胞法 | 第27页 |
| ·体细胞核移植 | 第27-28页 |
| ·病毒载体法 | 第28页 |
| ·精子载体法 | 第28-29页 |
| ·卵巢内直接注射 | 第29页 |
| ·基因打靶与转基因 | 第29-30页 |
| ·线粒体与转基因 | 第30页 |
| ·转基因RNAi 小鼠的制备 | 第30-32页 |
| ·研究概况 | 第31页 |
| ·基于病毒载体的转基因RNAi 小鼠 | 第31页 |
| ·诱导表达转基因RNAi 小鼠 | 第31页 |
| ·基因敲除与转基因RNAi | 第31-32页 |
| ·外源基因清除技术 | 第32-33页 |
| ·问题及展望 | 第33-34页 |
| 实验研究 | 第34-84页 |
| 前言 | 第34-35页 |
| 第三章 绿色荧光小鼠胎儿成纤维细胞的分离和培养 | 第35-43页 |
| ·材料与方法 | 第35-37页 |
| ·试验动物 | 第35页 |
| ·主要仪器及试剂 | 第35页 |
| ·主要溶液配制 | 第35-36页 |
| ·绿色荧光小鼠胎儿成纤维细胞的分离和培养 | 第36页 |
| ·MEF 的传代和冻存 | 第36页 |
| ·不同胰蛋白酶浓度消化传代MEF | 第36-37页 |
| ·不同消化液组合消化传代MEF | 第37页 |
| ·不同培养基培养MEF | 第37页 |
| ·G418 预筛选 | 第37页 |
| ·结果 | 第37-40页 |
| ·不同胎龄对分离细胞的影响 | 第37-38页 |
| ·绿色荧光小鼠MEF 细胞形态学观察 | 第38页 |
| ·不同分离方法的比较 | 第38页 |
| ·胰蛋白酶浓度和消化时间对细胞传代的影响 | 第38-39页 |
| ·不同消化液组合对分离细胞的影响 | 第39页 |
| ·不同培养液对细胞生长的影响 | 第39-40页 |
| ·MEF 最佳G418 筛选浓度的确定 | 第40页 |
| ·讨论 | 第40-41页 |
| ·小结 | 第41-43页 |
| 第四章 不同茎部长度shRNA 表达载体构建与鉴定 | 第43-60页 |
| ·材料与方法 | 第43-50页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·绿色荧光小鼠检测引物设计、PCR 体系及程序 | 第44-45页 |
| ·转绿色荧光蛋白小鼠鼠尾基因组DNA 的提取 | 第45页 |
| ·PCR 产物回收 | 第45页 |
| ·shRNA 表达载体构建 | 第45-48页 |
| ·绿色荧光小鼠胎儿成纤维细胞脂质体转染 | 第48页 |
| ·实时荧光定量PCR 检测 | 第48-50页 |
| ·结果 | 第50-57页 |
| ·转绿色荧光蛋白小鼠鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组质粒酶切鉴定及测序 | 第51页 |
| ·荧光定量PCR 产物电泳 | 第51页 |
| ·EGFP 基因和GAPDH 基因扩增效率曲线 | 第51-53页 |
| ·转染细胞的显微镜观察 | 第53-55页 |
| ·转染细胞实时荧光定量RT-PCR 分析 | 第55-56页 |
| ·肌肉注射组荧光定量PCR 结果分析 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| ·小结 | 第58-60页 |
| 第五章 不同茎部长度串联shRNA 载体构建及其干扰效应比较 | 第60-69页 |
| ·材料与方法 | 第60-64页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第60页 |
| ·shRNA 串联表达载体构建 | 第60-63页 |
| ·Vero 细胞的传代培养 | 第63页 |
| ·Vero 细胞转染 | 第63页 |
| ·小鼠腿部肌肉注射干扰载体 | 第63-64页 |
| ·细胞和肌肉总RNA 的提取及反转录 | 第64页 |
| ·实时荧光定量PCR 反应 | 第64页 |
| ·结果 | 第64-66页 |
| ·重组质粒酶切和测序鉴定 | 第64页 |
| ·Vero 细胞最佳G418 筛选浓度的确定 | 第64-65页 |
| ·干扰质粒对细胞荧光蛋白表达的影响 | 第65-66页 |
| ·干扰质粒转染细胞组荧光定量PCR 结果 | 第66页 |
| ·小鼠腿部肌肉注射组荧光定量PCR 结果 | 第66页 |
| ·讨论 | 第66-68页 |
| ·小结 | 第68-69页 |
| 第六章 显微注射法向小鼠体内导入shRNA 表达载体 | 第69-76页 |
| ·材料与方法 | 第69-72页 |
| ·试验动物 | 第69页 |
| ·主要仪器及试剂 | 第69页 |
| ·配制溶液 | 第69-70页 |
| ·注射用基因的准备 | 第70页 |
| ·结扎公鼠和受体母鼠的制备 | 第70页 |
| ·小鼠的超数排卵和胚胎获取 | 第70页 |
| ·外源基因的显微注射 | 第70-71页 |
| ·胚胎移植 | 第71-72页 |
| ·结果 | 第72-74页 |
| ·原核时期的控制 | 第72页 |
| ·受精卵的显微注射和胚胎移植 | 第72页 |
| ·显微注射胚胎的体外培养 | 第72页 |
| ·转基因小鼠的生产 | 第72-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| ·小结 | 第75-76页 |
| 第七章shRNA 表达载体负效应评价及其在仔鼠体内的整合检测 | 第76-84页 |
| ·材料与方法 | 第76-80页 |
| ·材料 | 第76页 |
| ·主要试剂和设备 | 第76页 |
| ·主要试剂及缓冲液的配制 | 第76-77页 |
| ·鼠尾基因组DNA 的提取 | 第77页 |
| ·PCR 检测 | 第77页 |
| ·小鼠尾静脉注射 | 第77-78页 |
| ·Southern 杂交探针的制备 | 第78页 |
| ·Southern 杂交 | 第78-80页 |
| ·结果 | 第80-82页 |
| ·尾静脉注射小鼠 | 第80-81页 |
| ·显微注射转基因小鼠的检测 | 第81-82页 |
| ·讨论 | 第82-83页 |
| ·小结 | 第83-84页 |
| 结论 | 第84页 |
| 创新点 | 第84页 |
| 进一步研究内容 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-97页 |
| 附录一 | 第97-99页 |
| 附录二 | 第99-102页 |
| 缩略词表 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 作者简介 | 第104页 |
