| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第10-22页 |
| 1.1 异种器官移植的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.2 猪作为异种移植供体 | 第11-14页 |
| 1.2.1 猪为异种移植供体的优势 | 第11页 |
| 1.2.2 猪作为异种移植供体存在的问题 | 第11-14页 |
| 1.3 血栓调节蛋白的研究进展 | 第14-17页 |
| 1.3.1 血栓调节蛋白的结构与分布 | 第14-15页 |
| 1.3.2 血栓调节蛋白的生物学功能 | 第15-16页 |
| 1.3.3 血栓调节蛋白表达的调节 | 第16-17页 |
| 1.4 与本研究相关技术 | 第17-19页 |
| 1.4.1 细菌人工染色体（BAC）研究概括 | 第17-18页 |
| 1.4.2 Red 同源重组技术研究进展 | 第18-19页 |
| 1.5 研究目的及意义 | 第19-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-28页 |
| 2.1.1 实验仪器及耗材 | 第22-23页 |
| 2.1.2 材料 | 第23-25页 |
| 2.1.3 实验试剂及溶液配制 | 第25-28页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第28页 |
| 2.2 利用 Red 同源重组系统介导的“gap–repair”技术获得猪 TM 启子 | 第28-34页 |
| 2.2.1 基因抓捕载体 PBR322–catch 的构建 | 第28-33页 |
| 2.2.2 抓捕 TM 基因启动子 | 第33-34页 |
| 2.3 hTM 表达载体 pBlueScript-hTM 的构建 | 第34-38页 |
| 2.3.1 构建好的表达载体 pBlueScript-hTM 示意图（图 2.2） | 第34页 |
| 2.3.2 载体 pBlueScript-hTM 各部分元件的获得 | 第34-35页 |
| 2.3.3 载体构建 | 第35-37页 |
| 2.3.4 无内毒素质粒 DNA 的大量制备（试剂盒法，用于细胞转染） | 第37页 |
| 2.3.5 线性化表达载体的回收、纯化 | 第37-38页 |
| 2.4 五指山小型猪耳成纤维体细胞的转染、筛选与鉴定 | 第38-40页 |
| 2.4.1 五指山小型猪耳成纤维系对嘌呤霉素毒性敏感性检测 | 第38页 |
| 2.4.2 细胞的电击转染及抗性克隆点筛选 | 第38-39页 |
| 2.4.3 克隆点的鉴定 | 第39页 |
| 2.4.4 阳性克隆细胞的保存和复苏 | 第39-40页 |
| 2.5 转 hTM 基因阳性细胞的核移植、胚胎移植 | 第40页 |
| 2.5.1 供体细胞的准备 | 第40页 |
| 2.5.2 体细胞核移植 | 第40页 |
| 2.5.3 胚胎移植和妊娠检测 | 第40页 |
| 2.6 转基因克隆仔猪的表达鉴定 | 第40-44页 |
| 2.6.1 组织基因组 DNA 的提取 | 第40-41页 |
| 2.6.2 组织 RNA 的提取 | 第41-42页 |
| 2.6.3 RNA 反转录合成 cDNA 第一条链 | 第42页 |
| 2.6.4 Western Blot | 第42-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-52页 |
| 3.1 利用 Red 同源重组系统介导的“gap–repair”技术获得猪 TM 启动子 | 第44-46页 |
| 3.1.1 五指山小型猪 TM BAC 质粒的提取 | 第44页 |
| 3.1.2 基因抓捕载体 pBR322–catch 的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.3 抓捕 TM 基因启动子 | 第45-46页 |
| 3.2 hTM 基因表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 3.3 五指山小型猪成纤维体细胞的转染、筛选与鉴定 | 第48页 |
| 3.3.1 五指山小型猪克隆细胞的鉴定 | 第48页 |
| 3.4 转 hTM 基因阳性细胞的核移植、胚胎移植 | 第48-49页 |
| 3.5 转基因克隆仔猪的表达鉴定 | 第49-52页 |
| 3.5.1 转基因仔猪耳组织基因组 DNA PCR 鉴定 | 第49页 |
| 3.5.2 转基因仔猪耳组织、脐带静脉血管 RT-PCR 鉴定 | 第49-50页 |
| 3.5.3 Western blot | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
