| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 引言 | 第11-21页 |
| 1.1 琼胶的简介 | 第11-12页 |
| 1.1.1 琼胶的来源和结构 | 第11页 |
| 1.1.2 琼胶的理化性质 | 第11-12页 |
| 1.1.3 琼胶的应用 | 第12页 |
| 1.2 琼胶酶的简介 | 第12-19页 |
| 1.2.1 琼胶酶的来源 | 第12-13页 |
| 1.2.2 琼胶酶的分类及其作用机制 | 第13-15页 |
| 1.2.3 琼胶酶活力的测定方法 | 第15页 |
| 1.2.4 琼胶酶的理化性质 | 第15-16页 |
| 1.2.5 琼胶酶的分子生物学研究 | 第16-18页 |
| 1.2.5.1 琼胶酶的生物学分类 | 第16-17页 |
| 1.2.5.2 琼胶酶GH模块的功能与机制 | 第17页 |
| 1.2.5.3 琼胶酶CBM的功能与机制 | 第17页 |
| 1.2.5.4 琼胶酶系的组学研究 | 第17-18页 |
| 1.2.6 琼胶酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 本课题的选题依据与研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 产琼胶酶微生物的筛选 | 第21-40页 |
| 2.1 材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 样品来源 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株和载体 | 第21页 |
| 2.1.3 引物 | 第21页 |
| 2.1.4 主要药品 | 第21-22页 |
| 2.1.5 培养基 | 第22页 |
| 2.1.6 常用试剂的配制 | 第22-23页 |
| 2.1.7 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-31页 |
| 2.2.1 产琼胶酶微生物的筛选 | 第24-25页 |
| 2.2.1.1 样品处理 | 第24页 |
| 2.2.1.2 平板初筛 | 第24页 |
| 2.2.1.3 摇瓶复筛 | 第24-25页 |
| 2.2.2 琼胶酶活力的测定 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 D-半乳糖标准曲线的制作 | 第25-26页 |
| 2.2.2.2 琼胶酶活力的测定 | 第26页 |
| 2.2.3 菌株形态观察 | 第26页 |
| 2.2.4 分子生物学鉴定 | 第26-30页 |
| 2.2.4.1 细菌基因组提取 | 第26-27页 |
| 2.2.4.2 放线菌基因组提取 | 第27-28页 |
| 2.2.4.3 16SrDNA序列的扩增 | 第28页 |
| 2.2.4.4 TA克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.4.5 阳性克隆子的筛选 | 第29-30页 |
| 2.2.4.6 16S rDNA序列分析与系统进化树的构建 | 第30页 |
| 2.2.5 菌种保藏 | 第30页 |
| 2.2.6 硫酸铵沉淀 | 第30-31页 |
| 2.2.7 粗酶液酶学性质的初步研究 | 第31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-38页 |
| 2.3.1 产琼胶酶微生物的筛选 | 第31-34页 |
| 2.3.1.1 平板初筛结果 | 第31-33页 |
| 2.3.1.2 摇瓶复筛结果 | 第33-34页 |
| 2.3.2 产琼胶酶微生物鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.2.1 菌株形态观察 | 第34页 |
| 2.3.2.2 分子生物学鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.3 粗酶液的酶学性质 | 第36-38页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第38-40页 |
| 第三章 琼胶酶基因的克隆 | 第40-55页 |
| 3.1 材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 引物 | 第40-41页 |
| 3.1.2 主要药品 | 第41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 简并引物的设计 | 第41页 |
| 3.2.2 琼胶酶基因片段的扩增 | 第41-42页 |
| 3.2.3 琼胶酶基因片段的序列分析、系统发育分析 | 第42页 |
| 3.2.4 琼胶酶基因全长序列的扩增 | 第42-44页 |
| 3.2.4.1 琼胶酶基因侧翼序列的扩增 | 第42-44页 |
| 3.2.4.2 琼胶酶基因全长序列的拼接及分析 | 第44页 |
| 3.3 结果与分析 | 第44-53页 |
| 3.3.1 简并引物的设计与验证 | 第44-45页 |
| 3.3.1.1 保守区域的确定及简并引物的设计 | 第44-45页 |
| 3.3.1.2 简并引物的验证 | 第45页 |
| 3.3.2 琼胶酶基因片段的序列分析 | 第45-48页 |
| 3.3.2.1 序列分析 | 第45-47页 |
| 3.3.2.2 系统进化分析 | 第47-48页 |
| 3.3.3 目的基因序列的选择 | 第48-49页 |
| 3.3.4 琼胶酶基因全长序列的克隆 | 第49-53页 |
| 3.3.4.1 Vibrio sp.ZC-1琼胶酶基因侧翼序列的扩增 | 第49-50页 |
| 3.3.4.2 琼胶酶基因全长序列的分析 | 第50-52页 |
| 3.3.4.3 信号肽的预测 | 第52页 |
| 3.3.4.4 AgaZC-1蛋白结构的模拟 | 第52-53页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第53-55页 |
| 第四章 agaZC-1在大肠杆菌中的表达 | 第55-69页 |
| 4.1 材料 | 第55-56页 |
| 4.1.1 菌株和载体 | 第55页 |
| 4.1.2 引物 | 第55页 |
| 4.1.3 主要药品 | 第55页 |
| 4.1.4 常用溶液 | 第55-56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-61页 |
| 4.2.1 琼胶酶基因的克隆 | 第56页 |
| 4.2.2 表达重组质粒的构建 | 第56-57页 |
| 4.2.3 大肠杆菌工程菌株的构建 | 第57-59页 |
| 4.2.3.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备 | 第57-58页 |
| 4.2.3.2 重组质粒pET-agaZC-1的提取 | 第58页 |
| 4.2.3.3 重组菌株的筛选 | 第58-59页 |
| 4.2.4 琼胶酶重组菌的诱导表达 | 第59页 |
| 4.2.5 重组蛋白rAgaZC-1的检测 | 第59-60页 |
| 4.2.5.1 酶活测定 | 第59页 |
| 4.2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 | 第59-60页 |
| 4.2.6 重组菌产酶条件的优化 | 第60-61页 |
| 4.2.6.1 培养基初始pH对产酶的影响 | 第60页 |
| 4.2.6.2 IPTG添加量对产酶的影响 | 第60页 |
| 4.2.6.3 诱导OD600对产酶的影响 | 第60页 |
| 4.2.6.4 诱导时间对产酶的影响 | 第60-61页 |
| 4.2.6.5 诱导温度对产酶的影响 | 第61页 |
| 4.2.6.6 装液量对产酶的影响 | 第61页 |
| 4.2.6.7 转速对产酶的影响 | 第61页 |
| 4.3 结果与分析 | 第61-68页 |
| 4.3.1 琼胶酶基因的克隆 | 第61-62页 |
| 4.3.2 agaZC-1在大肠杆菌中的表达 | 第62-63页 |
| 4.3.3 SDS-PAGE电泳检测 | 第63-64页 |
| 4.3.4 重组菌产酶条件的优化 | 第64-68页 |
| 4.3.4.1 培养基初始pH对产酶的影响 | 第64页 |
| 4.3.4.2 IPTG添加量对产酶的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.4.3 诱导OD600对产酶的影响 | 第65-66页 |
| 4.3.4.4 诱导时间对产酶的影响 | 第66页 |
| 4.3.4.5 诱导温度对产酶的影响 | 第66-67页 |
| 4.3.4.6 装液量对产酶的影响 | 第67页 |
| 4.3.4.7 转速对产酶的影响 | 第67-68页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第68-69页 |
| 第五章 重组琼胶酶的酶学性质研究 | 第69-79页 |
| 5.1 材料 | 第69页 |
| 5.1.1 主要药品 | 第69页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第69页 |
| 5.2 实验方法 | 第69-72页 |
| 5.2.1 重组酶的分离纯化 | 第69-70页 |
| 5.2.1.1 重组酶rAgaZC-1的大量诱导及浓缩 | 第69页 |
| 5.2.1.2 重组酶rAgaZC-1的镍柱纯化 | 第69-70页 |
| 5.2.1.3 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第70页 |
| 5.2.2 重组酶的酶学性质研究 | 第70-72页 |
| 5.2.2.1 重组酶的最适pH及pH稳定性的测定 | 第70页 |
| 5.2.2.2 重组酶的最适温度及热稳定性的测定 | 第70-71页 |
| 5.2.2.3 不同金属离子及化学试剂对重组酶活性的影响 | 第71页 |
| 5.2.2.4 比活力的测定 | 第71页 |
| 5.2.2.5 酶的动力学参数测定 | 第71-72页 |
| 5.2.2.6 底物特异性测定 | 第72页 |
| 5.2.3 产物分析 | 第72页 |
| 5.3 结果与分析 | 第72-77页 |
| 5.3.1 重组酶rAgaZC-1的纯化 | 第72-73页 |
| 5.3.2 重组酶rAgaZC-1的酶学性质研究 | 第73-76页 |
| 5.3.2.1 重组酶rAgaZC-1的最适反应pH值及pH稳定性 | 第73页 |
| 5.3.2.2 重组酶rAgaZC-1的最适反应温度及热稳定性 | 第73-74页 |
| 5.3.2.3 不同金属离子及化学试剂对重组酶活性的影响 | 第74-75页 |
| 5.3.2.4 重组酶的比活力 | 第75页 |
| 5.3.2.5 重组酶的K_m和V_(max) | 第75-76页 |
| 5.3.2.6 重组酶rAgaZC-1的底物特异性 | 第76页 |
| 5.3.3 重组酶rAgaZC-1的产物分析 | 第76-77页 |
| 5.4 讨论与小结 | 第77-79页 |
| 结论与展望 | 第79-81页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 个人简历 | 第88页 |
