| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-28页 |
| 1.1 萜类化合物 | 第15-16页 |
| 1.1.1 萜类的重要性 | 第15页 |
| 1.1.2 萜类的生物合成 | 第15-16页 |
| 1.1.3 萜类的生产方法 | 第16页 |
| 1.2 合成生物学及其应用 | 第16-25页 |
| 1.2.1 合成生物学研究的关键技术 | 第17-21页 |
| 1.2.1.1 基因组测序及功能基因的挖掘 | 第17页 |
| 1.2.1.2 DNA合成与组装技术 | 第17-18页 |
| 1.2.1.3 合成生物学元件标准化与设计 | 第18-19页 |
| 1.2.1.4 染色体改造和基因组删减技术 | 第19-21页 |
| 1.2.1.5 合成生物学器件与系统装配技术 | 第21页 |
| 1.2.2 合成生物学在人工生物合成体系构建中的应用 | 第21-25页 |
| 1.2.2.1 合成生物学与天然产物药物异源合成 | 第22-24页 |
| 1.2.2.2 合成生物学与生物能源合成 | 第24-25页 |
| 1.2.2.3 合成生物学与功能基因回路的设计 | 第25页 |
| 1.3 萜类等天然产物合成生物学研究面临的问题 | 第25-27页 |
| 1.3.1 调控元件的理性设计问题 | 第25页 |
| 1.3.2 前体供应问题 | 第25-26页 |
| 1.3.3 产物的转运问题 | 第26-27页 |
| 1.3.4 异源合成工程菌株发酵调控问题 | 第27页 |
| 1.4 本课题的主要研究内容及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 研究材料与方法 | 第28-38页 |
| 2.1 主要实验仪器 | 第28页 |
| 2.2 主要研究材料及试剂配制 | 第28-32页 |
| 2.2.1 常用菌株与质粒 | 第28-29页 |
| 2.2.2 主要分子生物学相关酶、试剂盒和抗生素等 | 第29页 |
| 2.2.3 微生物常规培养、发酵和样品检测药品 | 第29页 |
| 2.2.4 主要分子生物学试剂配制 | 第29-32页 |
| 2.2.4.1 核酸电泳相关试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.4.2 SDS-PAGE电泳胶及其他试剂配制 | 第30-31页 |
| 2.2.4.3 Tricine-SDS-PAGE电泳胶及其他试剂配制 | 第31页 |
| 2.2.4.4 主要基因组DNA抽提试剂 | 第31-32页 |
| 2.2.5 微生物培养基配方 | 第32页 |
| 2.3 主要实验方法 | 第32-38页 |
| 2.3.1 常规的微生物培养与保存 | 第32-33页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌培养 | 第32-33页 |
| 2.3.1.2 枯草芽胞杆菌培养 | 第33页 |
| 2.3.1.3 阿维链霉菌培养 | 第33页 |
| 2.3.1.4 红霉糖多胞菌培养 | 第33页 |
| 2.3.1.5 Erwinia taxi培养 | 第33页 |
| 2.3.2 常规的分子生物学操作 | 第33-36页 |
| 2.3.2.1 质粒小量抽提 | 第33页 |
| 2.3.2.2 DNA的胶回收与直接清洁回收 | 第33页 |
| 2.3.2.3 细菌基因组DNA抽提 | 第33页 |
| 2.3.2.4 大肠杆菌RNA的抽提 | 第33-34页 |
| 2.3.2.5 基因的密码子优化与人工合成 | 第34页 |
| 2.3.2.6 分子克隆与质粒的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第35页 |
| 2.3.2.8 Tricine-SDS-PAGE方法 | 第35页 |
| 2.3.2.9 实时定量PCR | 第35-36页 |
| 2.3.3 工程菌发酵与产物分析 | 第36-38页 |
| 2.3.3.1 发酵种子制备 | 第36页 |
| 2.3.3.2 摇瓶发酵 | 第36页 |
| 2.3.3.3 补料分批发酵 | 第36页 |
| 2.3.3.4 发酵过程参数检测 | 第36-37页 |
| 2.3.3.5 发酵过程产物检测 | 第37-38页 |
| 第三章 调控元件的理性设计 | 第38-59页 |
| 3.1 主要实验材料与方法 | 第38-44页 |
| 3.1.1 主要实验材料与计算机平台 | 第38-40页 |
| 3.1.2 常规实验操作 | 第40页 |
| 3.1.3 调控元件文库的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.3.1 报告载体构建 | 第40页 |
| 3.1.3.2 调控元件突变库的构建 | 第40页 |
| 3.1.2.3 调控元件文库的初筛 | 第40-41页 |
| 3.1.2.4 调控元件文库的精确定量 | 第41页 |
| 3.1.4 强度预测模型构建方法 | 第41-43页 |
| 3.1.4.1 基于PWM的序列-强度建模方法 | 第41-42页 |
| 3.1.4.2 基于ANN的序列-强度建模方法 | 第42-43页 |
| 3.1.5 表达框的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.5.1 小肽BmK1表达框的构建 | 第43页 |
| 3.1.5.2 白藜芦醇合成途径的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.5.3 紫槐二烯合成途径装配与dxs基因表达框构建 | 第44页 |
| 3.2 实验结果与讨论 | 第44-57页 |
| 3.2.1 基于随机突变的调控元件文库的构建 | 第44-46页 |
| 3.2.2 调控元件突变库的建模 | 第46-49页 |
| 3.2.2.1 基于PWM方法的预测模型构建 | 第46-47页 |
| 3.2.2.2 基于ANN的预测模型的构建 | 第47-49页 |
| 3.2.3 人工调控元件的定量设计 | 第49-53页 |
| 3.2.4 人工设计调控元件的应用 | 第53-57页 |
| 3.2.4.1 人工设计调控元件对小肽BmK1的表达的优化 | 第53-54页 |
| 3.2.4.2 人工设计元件途径适配中的应用 | 第54-57页 |
| 3.3 小结 | 第57-59页 |
| 第四章 MEP途径异源催化元件筛选及应用 | 第59-73页 |
| 4.1 主要实验材料与方法 | 第59-63页 |
| 4.1.1 主要实验材料 | 第59-61页 |
| 4.1.2 主要质粒的构建流程 | 第61-63页 |
| 4.1.2.1 萜类化合物下游合成途径的构建 | 第61-62页 |
| 4.1.2.2 MEP模块质粒的构建 | 第62-63页 |
| 4.1.3 摇瓶发酵与产物检测 | 第63页 |
| 4.1.4 工程菌株的MEP途径转录分析 | 第63页 |
| 4.2 实验结果与讨论 | 第63-71页 |
| 4.2.1 E.coli中萜类异源合成途径的装配与产物合成 | 第63页 |
| 4.2.2 E.coli内源MEP途径关键基因的强化提高萜类的合成 | 第63-65页 |
| 4.2.3 强化关键基因对E.coli内源MEP途径转录的影响 | 第65-66页 |
| 4.2.4 异源MEP途径催化元件的筛选 | 第66-69页 |
| 4.2.5 最佳基因模块的组合强化改造MEP途径 | 第69-71页 |
| 4.3 小结 | 第71-73页 |
| 第五章 用于萜类合成的大肠杆菌底盘全局网络改造 | 第73-84页 |
| 5.1 主要实验材料与方法 | 第74-78页 |
| 5.1.1 主要实验材料 | 第74-77页 |
| 5.1.2 主要质粒与菌株的构建流程 | 第77-78页 |
| 5.1.2.1 强化靶点相关质粒的构建 | 第77-78页 |
| 5.1.2.2 敲除菌株的构建 | 第78页 |
| 5.1.3 摇瓶、补料分批发酵 | 第78页 |
| 5.1.4 菌体生长与产物检测 | 第78页 |
| 5.2 实验结果与讨论 | 第78-83页 |
| 5.2.1 in silico预测潜在敲除靶点对萜类合成的影响 | 第78-80页 |
| 5.2.2 强化靶点对萜类合成的影响 | 第80-81页 |
| 5.2.3 各靶点组合表达对萜类合成的影响 | 第81-83页 |
| 5.3 小结 | 第83-84页 |
| 第六章 大肠杆菌萜类合成系统的转运模块改造 | 第84-93页 |
| 6.1 主要实验材料与方法 | 第84-86页 |
| 6.1.1 主要实验材料 | 第84-85页 |
| 6.1.2 质粒的构建流程 | 第85-86页 |
| 6.1.2.1 外排泵系统质粒的构建 | 第86页 |
| 6.1.2.2 氯霉素抗性MEP途径强化质粒的构建 | 第86页 |
| 6.1.3 摇瓶发酵与产物检测 | 第86页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第86-92页 |
| 6.2.1 内源转运泵组分单独表达对萜类合成的影响 | 第86-88页 |
| 6.2.2 绿脓杆菌MexAB-OprM外排泵对萜类合成的影响 | 第88-89页 |
| 6.2.3 外排各组分组合表达对产物合成的影响 | 第89-90页 |
| 6.2.4 各组分比例精细调控对萜类合成的影响 | 第90-92页 |
| 6.3 小结 | 第92-93页 |
| 第七章 大肠杆菌萜类异源合成的糖流加控制 | 第93-98页 |
| 7.1 实验材料与方法 | 第93页 |
| 7.1.1 相关菌株与培养基 | 第93页 |
| 7.1.2 摇瓶发酵与补料分批发酵 | 第93页 |
| 7.1.3 摇瓶发酵与产物检测 | 第93页 |
| 7.2 实验结果与讨论 | 第93-97页 |
| 7.2.1 补料分批高密度发酵过程的建立 | 第93-95页 |
| 7.2.2 稳定期补糖控制对紫槐二烯合成的影响 | 第95-96页 |
| 7.2.3 控制对数生长期补糖对菌体生长及紫槐二烯合成的影响 | 第96-97页 |
| 7.3 小结 | 第97-98页 |
| 第八章 总结与展望 | 第98-100页 |
| 8.1 总结与创新点 | 第98-99页 |
| 8.2 展望 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-109页 |
| 附录1 TRC启动子&RBS突变文库中100个元件的序列及强度 | 第109-120页 |
| 附录2 人工设计和合成的TRC启动子&RBS调控元件序列 | 第120-121页 |
| 附录3 用于模型NET90_19_576的训练和验证的数据集 | 第121-122页 |
| 附录4 本研究中人工合成的基因序列 | 第122-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 攻读博士学位期间发表文章与申请专利 | 第128-129页 |
