| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-26页 |
| 1.1 2-酮基葡萄糖酸概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 2-酮基葡萄糖酸的理化性质 | 第12页 |
| 1.1.2 2-酮基葡萄糖酸的应用 | 第12页 |
| 1.1.3 2-酮基葡萄糖酸的生产方法以及生产菌株 | 第12-13页 |
| 1.2 假单胞菌Ptx S蛋白的研究进展 | 第13-19页 |
| 1.2.1 假单胞菌Ptx S蛋白的发现 | 第13页 |
| 1.2.2 假单胞菌Ptx S的多效性调控机制 | 第13-18页 |
| 1.2.3 假单胞菌Ptx S蛋白的结构 | 第18-19页 |
| 1.3 以大肠杆菌为宿主进行目的蛋白的表达 | 第19-20页 |
| 1.4 蛋白的分离纯化技术 | 第20-24页 |
| 1.4.1 亲和层析 | 第21-22页 |
| 1.4.2 离子交换层析 | 第22页 |
| 1.4.3 凝胶过滤层析 | 第22-23页 |
| 1.4.4 反胶束溶剂法 | 第23页 |
| 1.4.5 双水相萃取技术 | 第23-24页 |
| 1.4.6 多种分离方法相结合的蛋白纯化技术 | 第24页 |
| 1.5 课题的提出 | 第24-25页 |
| 1.6 研究的主要内容 | 第25-26页 |
| 第二章 变形假单胞菌 2-酮基葡萄糖酸代谢调控蛋白Ptx S基因的克隆与分析 | 第26-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 实验试剂与仪器设备 | 第26-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.2.1 变形假单胞菌JUIM01总DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.2 DNA浓度的测定 | 第29页 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度与纯度 | 第29-30页 |
| 2.2.4 PCR引物的设计 | 第30页 |
| 2.2.5 PCR扩增ptx S基因 | 第30页 |
| 2.2.6 PCR产物的回收与纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.7 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.8 重组质粒的构建 | 第32页 |
| 2.2.9 重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.10 重组质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.11 Ptx S蛋白的基因序列以及氨基酸序列的生物信息学分析 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-45页 |
| 2.3.1 变形假单胞菌JUIM01基因组DNA的提取 | 第35页 |
| 2.3.2 变形假单胞菌Ptx S基因的克隆 | 第35-36页 |
| 2.3.3 重组质粒p MD19-T-ptx S的构建与验证 | 第36-37页 |
| 2.3.4 变形假单胞菌Ptx S蛋白的基因序列以及氨基酸序列分析 | 第37-39页 |
| 2.3.5 变形假单胞菌Ptx S蛋白的系统进化树的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.6 变形假单胞菌Ptx S蛋白的理化性质 | 第40-41页 |
| 2.3.7 变形假单胞菌Ptx S蛋白的细胞定位、跨膜区域、信号肽及疏水性分析 | 第41-42页 |
| 2.3.8 变形假单胞菌 Ptx S 蛋白的结构域预测 | 第42-43页 |
| 2.3.9 变形假单胞菌Ptx S蛋白的二级结构预测 | 第43页 |
| 2.3.10 变形假单胞菌Ptx S蛋白的三级结构预测 | 第43-44页 |
| 2.3.11 变形假单胞菌Ptx S蛋白互作网络的预测和分析 | 第44-45页 |
| 2.4 本章小结 | 第45-46页 |
| 第三章 变形假单胞菌Ptx S蛋白的异源表达、分离纯化及鉴定 | 第46-62页 |
| 3.1 实验材料 | 第46-48页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第46页 |
| 3.1.2 变形假单胞菌JUIM01基因组DNA | 第46页 |
| 3.1.3 主要试剂及配制 | 第46-48页 |
| 3.1.4 主要仪器设备与材料 | 第48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-54页 |
| 3.2.1 PCR引物的设计与合成 | 第48-49页 |
| 3.2.2 PCR扩增目的基因 | 第49页 |
| 3.2.3 PCR产物的回收方法 | 第49页 |
| 3.2.4 重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 3.2.5 感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 3.2.6 大肠杆菌DH5α的转化 | 第50页 |
| 3.2.7 重组质粒的鉴定 | 第50页 |
| 3.2.8 重组菌株的诱导表达 | 第50-51页 |
| 3.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第51-52页 |
| 3.2.10 重组蛋白的纯化 | 第52-53页 |
| 3.2.11 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析 | 第53-54页 |
| 3.2.12 蛋白浓度的测定 | 第54页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第54-61页 |
| 3.3.1 变形假单胞菌ptx S基因的克隆 | 第54-55页 |
| 3.3.2 重组质粒p ET-28a -ptx S的构建与验证 | 第55-57页 |
| 3.3.3 重组菌株E. coli BL21(DE3)/p ET-28a-ptx S的构建及诱导表达 | 第57页 |
| 3.3.4 重组蛋白Ptx S的分离纯化 | 第57-59页 |
| 3.3.5 变形假单胞菌Ptx S蛋白的MALDI-TOF-MS分析 | 第59-61页 |
| 3.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第四章 变形假单胞菌Ptx S蛋白结构与功能的初步研究 | 第62-82页 |
| 4.1 实验材料 | 第62-64页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第62页 |
| 4.1.2 主要试剂及配制 | 第62-63页 |
| 4.1.3 培养基 | 第63页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第63-64页 |
| 4.2 实验方法 | 第64-71页 |
| 4.2.1 Ptx S蛋白的圆二色（CD）光谱分析 | 第64页 |
| 4.2.2 Ptx S蛋白的动态光散射（DLS）分析 | 第64页 |
| 4.2.3 ptx S基因敲除突变体的构建 | 第64-69页 |
| 4.2.4 2KGA发酵实验 | 第69-70页 |
| 4.2.5 等温滴定量热法（ITC）实验 | 第70页 |
| 4.2.6 反向重复序列的比对检索以及合成 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-80页 |
| 4.3.1 变形假单胞菌Ptx S蛋白的二级结构 | 第71页 |
| 4.3.2 变形假单胞菌Ptx S蛋白的动态光散射（DLS）检测结果 | 第71-72页 |
| 4.3.3 ptx S基因左右同源臂的克隆 | 第72-73页 |
| 4.3.4 Overlap PCR连接扩增左右同源臂 | 第73页 |
| 4.3.5 重组敲除质粒pk18mob Sac BΔptx S的构建与验证 | 第73-74页 |
| 4.3.6 重组菌株变形假单胞菌JUIM01Δ ptx S的构建 | 第74-75页 |
| 4.3.7 ptx S基因缺失对 2KGA合成的影响 | 第75-77页 |
| 4.3.8 变形假单胞菌Ptx S蛋白的效应物分子 | 第77-79页 |
| 4.3.9 变形假单胞菌Ptx S蛋白与ptx S基因及kgu操纵子的结合位点 | 第79-80页 |
| 4.4 本章小结 | 第80-82页 |
| 第五章 工作总结与展望 | 第82-84页 |
| 5.1 全文主要结论 | 第82-83页 |
| 5.2 存在问题与展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第93页 |
