| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-46页 |
| 1.1 概述 | 第20-22页 |
| 1.2 国内外研究进展 | 第22-41页 |
| 1.2.1 GABA | 第22-29页 |
| 1.2.1.1 GABA理化性质 | 第22-23页 |
| 1.2.1.2 GABA生理功能 | 第23页 |
| 1.2.1.3 GABA的应用 | 第23-25页 |
| 1.2.1.4 GABA在生物体内的代谢途径 | 第25-26页 |
| 1.2.1.5 GABA生产制备方法 | 第26-29页 |
| 1.2.2 乳酸菌 | 第29-33页 |
| 1.2.2.1 乳酸菌及其应用 | 第29-31页 |
| 1.2.2.2 乳酸菌所面临的环境胁迫 | 第31页 |
| 1.2.2.3 抵御环境酸胁迫的耐受与响应机制 | 第31-33页 |
| 1.2.3 乳酸菌生产GABA的研究进展 | 第33-39页 |
| 1.2.3.1 高产GABA乳酸菌的筛选与鉴定 | 第34-35页 |
| 1.2.3.2 乳酸菌GAD系统关键蛋白的酶学特性 | 第35-36页 |
| 1.2.3.3 乳酸菌发酵生产GABA的调控策略 | 第36-39页 |
| 1.2.3.4 乳酸菌遗传改造提升GABA合成效率的研究 | 第39页 |
| 1.2.4 生理工程策略提升乳酸菌合成GABA的理论基础 | 第39-41页 |
| 1.2.4.1 微生物生理工程 | 第39-40页 |
| 1.2.4.2 基于生理工程策略提升乳酸菌生产性能的研究 | 第40-41页 |
| 1.3 本论文的主要研究内容 | 第41-46页 |
| 1.3.1 立题依据与研究意义 | 第41-43页 |
| 1.3.2 本论文的主要研究思路和内容 | 第43-46页 |
| 第二章 短乳杆菌GAD系统基因的表达调控与功能分析 | 第46-72页 |
| 2.1 前言 | 第46-47页 |
| 2.2 材料与方法 | 第47-57页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第47-48页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第48页 |
| 2.2.2.1 试剂 | 第48页 |
| 2.2.2.2 仪器 | 第48页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第48-49页 |
| 2.2.3.1 培养基 | 第48-49页 |
| 2.2.3.2 发酵培养条件 | 第49页 |
| 2.2.4 分子生物学操作 | 第49-55页 |
| 2.2.4.1 细菌基因组和质粒提取 | 第49页 |
| 2.2.4.2 基因产物回收 | 第49页 |
| 2.2.4.3 短乳杆菌耐受酸胁迫途径中关键系统基因的克隆解析 | 第49-50页 |
| 2.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第50页 |
| 2.2.4.5 短乳杆菌感受态的制备 | 第50-51页 |
| 2.2.4.6 短乳杆菌电击转化 | 第51页 |
| 2.2.4.7 短乳杆菌基因缺失菌株的构建与筛选 | 第51-53页 |
| 2.2.4.8 短乳杆菌基因缺失回补菌株的构建 | 第53页 |
| 2.2.4.9 荧光定量PCR测定GAD系统关键基因转录 | 第53-55页 |
| 2.2.5 短乳杆菌酸胁迫实验 | 第55页 |
| 2.2.6 GAD与ADI蛋白的表达及纯化 | 第55-56页 |
| 2.2.7 短乳杆菌精氨酸及谷氨酸代谢特征分析 | 第56页 |
| 2.2.8 精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸含量的测定 | 第56页 |
| 2.2.9 GABA和谷氨酸含量的测定 | 第56-57页 |
| 2.2.10 菌体生物量的测定 | 第57页 |
| 2.2.11 菌体GAD催化活力的表征 | 第57页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第57-69页 |
| 2.3.1 短乳杆菌电击转化方法的建立 | 第57-58页 |
| 2.3.2 短乳杆菌抗酸系统中关键途径基因结构及组成 | 第58页 |
| 2.3.3 基于基因表型的短乳杆菌抗酸机制分析 | 第58-60页 |
| 2.3.4 短乳杆菌GAD系统基因结构特征 | 第60-62页 |
| 2.3.5 短乳杆菌中gadRCB基因簇的表达受pH调控 | 第62-64页 |
| 2.3.6 短乳杆菌中gadB和gadC形成gadCB操纵子并共同转录表达 | 第64-66页 |
| 2.3.7 GadR阳性调节gadCB操纵子的表达 | 第66-67页 |
| 2.3.8 GadC与GadB蛋白共同赋予短乳杆菌合成GABA的性能 | 第67-68页 |
| 2.3.9 GAD系统是短乳杆菌抵御酸胁迫的重要途径 | 第68-69页 |
| 2.4 本章小结 | 第69-72页 |
| 第三章 弱化F_lF_o-ATPASE活性促进短乳杆菌GABA的合成 | 第72-90页 |
| 3.1 前言 | 第72-73页 |
| 3.2 材料与方法 | 第73-77页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第73页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第73-74页 |
| 3.2.2.1 试剂 | 第73-74页 |
| 3.2.2.2 仪器 | 第74页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第74-75页 |
| 3.2.3.1 培养基 | 第74页 |
| 3.2.3.2 发酵培养条件 | 第74-75页 |
| 3.2.4 短乳杆菌重组菌株的构建 | 第75页 |
| 3.2.5 短乳杆菌F_lF_o-ATPase缺陷菌株的选育 | 第75-76页 |
| 3.2.6 短乳杆菌胞内pH的测定 | 第76页 |
| 3.2.7 细胞膜组分的分离 | 第76页 |
| 3.2.8 ATPase活性分析 | 第76-77页 |
| 3.2.9 基于比色法的高GAD活性突变菌株高通量筛选 | 第77页 |
| 3.2.10 DCCD对GAD及ATPase活性的影响 | 第77页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第77-87页 |
| 3.3.1 GAD系统关键蛋白在Lb. brevis CGMCC 1306中的重组表达 | 第77-78页 |
| 3.3.2 过表达GAD系统关键蛋白增强Lb. brevis CGMCC 1306细胞GAD活性 | 第78-80页 |
| 3.3.3 弱化F_lF_o-ATPase活性对Lb. brevis CGMCC 1306细胞GAD活性的影响 | 第80-82页 |
| 3.3.4 基于pH敏感指示剂比色法的高GAD活性菌株高通量筛选方法建立 | 第82-83页 |
| 3.3.5 F_lF_o-ATPase活性弱化Lb. brevis/pMG36e-gadA突变株的选育 | 第83-84页 |
| 3.3.6 典型F_lF_o-ATPase缺陷菌株中细胞内微环境的差异 | 第84-86页 |
| 3.3.7 典型F_lF_o-ATPase缺陷菌株GABA合成性能分析 | 第86-87页 |
| 3.4 本章小结 | 第87-90页 |
| 第四章 GAD系统关键元件筛选、改造及组合提升短乳杆菌GABA合成性能 | 第90-106页 |
| 4.1 前言 | 第90-91页 |
| 4.2 材料与方法 | 第91-96页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第91-92页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第92页 |
| 4.2.2.1 试剂 | 第92页 |
| 4.2.2.2 仪器 | 第92页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第92-93页 |
| 4.2.3.1 培养基 | 第92-93页 |
| 4.2.3.2 发酵培养条件 | 第93页 |
| 4.2.4 大肠杆菌重组菌株的构建 | 第93页 |
| 4.2.5 短乳杆菌重组菌株的构建 | 第93-94页 |
| 4.2.6 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第94-95页 |
| 4.2.7 重组GAD的纯化 | 第95页 |
| 4.2.8 重组GAD酶学特性分析 | 第95页 |
| 4.2.9 短乳杆菌诱导表达 | 第95页 |
| 4.2.10 短乳杆菌细胞粗酶液的制备 | 第95页 |
| 4.2.11 菌体表观GAD活性的测定 | 第95-96页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第96-105页 |
| 4.3.1 乳酸菌源GAD在不同pH条件下的催化特性 | 第96-98页 |
| 4.3.2 具有较宽pH活性范围GAD的获取及酶学性质分析 | 第98-99页 |
| 4.3.3 定向改造LpGAD拓宽其pH活性范围 | 第99-100页 |
| 4.3.4 过表达C末端截短的LpGAD突变体提升短乳杆菌GAD活性 | 第100-102页 |
| 4.3.5 GAD系统关键蛋白组合提升短乳杆菌催化活性 | 第102-103页 |
| 4.3.6 补料分批发酵条件下重组菌株GABA合成性能分析 | 第103-105页 |
| 4.4 本章小结 | 第105-106页 |
| 第五章 重构乳酸菌模式菌株GAD系统强化其GABA合成性能 | 第106-124页 |
| 5.1 前言 | 第106-107页 |
| 5.2 材料与方法 | 第107-111页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第107页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第107-108页 |
| 5.2.2.1 试剂 | 第107-108页 |
| 5.2.2.2 仪器 | 第108页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第108-109页 |
| 5.2.3.1 培养基 | 第108页 |
| 5.2.3.2 发酵培养条件 | 第108-109页 |
| 5.2.4 乳酸乳球菌感受态细胞制备 | 第109页 |
| 5.2.5 乳酸乳球菌感受态细胞的电击转化 | 第109页 |
| 5.2.6 乳酸乳球菌重组菌株的构建 | 第109-110页 |
| 5.2.7 重组乳酸乳球菌的诱导表达及代谢产物分析 | 第110-111页 |
| 5.2.8 乳酸乳球菌胞内ATP及ADP含量的测定 | 第111页 |
| 5.2.9 乳酸乳球菌胞内GABA含量的测定 | 第111页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第111-121页 |
| 5.3.1 Lc. lactis subsp. lactis CV56的GAD系统基因结构及组成 | 第111-112页 |
| 5.3.2 过量表达GAD系统关键蛋白对乳酸乳球菌GABA合成的影响 | 第112-114页 |
| 5.3.3 GAD系统关键基因重排强化乳酸乳球菌GABA合成效率 | 第114-115页 |
| 5.3.4 拓宽重组乳酸乳球菌胞内GadB蛋白pH活性范围提升GABA合成效率 | 第115-116页 |
| 5.3.5 重构有氧呼吸代谢途径提升乳酸乳球菌细胞生物量 | 第116-118页 |
| 5.3.6 好氧条件下乳酸乳球菌GABA合成性能分析 | 第118-119页 |
| 5.3.7 有氧呼吸抑制乳酸乳球菌GABA的合成 | 第119-120页 |
| 5.3.8 重构乳酸乳球菌有氧呼吸途径益于维持其胞内近中性环境 | 第120-121页 |
| 5.3.9 有氧呼吸抑制乳酸乳球菌GABA合成的机理 | 第121页 |
| 5.4 本章小节 | 第121-124页 |
| 第六章 构建基于乳酸乳球菌可控裂解系统提升乳酸菌混合发酵体系中GABA的合成 | 第124-142页 |
| 6.1 前言 | 第124-125页 |
| 6.2 材料与方法 | 第125-131页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第125-127页 |
| 6.2.2 试剂和仪器 | 第127页 |
| 6.2.2.1 试剂 | 第127页 |
| 6.2.2.2 仪器 | 第127页 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 | 第127-128页 |
| 6.2.3.1 培养基 | 第127-128页 |
| 6.2.3.2 发酵培养条件 | 第128页 |
| 6.2.4 乳酸乳球菌重组菌株的构建 | 第128-131页 |
| 6.2.5 重组短乳杆菌诱导表达 | 第131页 |
| 6.2.6 重组乳酸乳球菌诱导表达 | 第131页 |
| 6.2.7 乳酸菌混合发酵体系的诱导表达 | 第131页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第131-141页 |
| 6.3.1 乳酸菌自溶酶AcmA介导的乳酸乳球菌可控裂解 | 第131-133页 |
| 6.3.2 温和型噬菌体rlt裂解盒LytHA介导的乳酸乳球菌可控裂解 | 第133-134页 |
| 6.3.3 基于LytHA的乳酸乳球菌可控裂解系统提升其GABA合成效率 | 第134-135页 |
| 6.3.4 重组可控裂解乳酸乳球菌GABA合成性能分析 | 第135-136页 |
| 6.3.5 乳酸菌混合发酵体系中可控裂解系统“平台菌株”的构建 | 第136-137页 |
| 6.3.6 粪肠球菌细菌素EnlA介导的乳酸乳球菌可控裂解系统 | 第137-138页 |
| 6.3.7 基于细菌素EnlA的可控裂解系统提升乳酸乳球菌混合发酵体系GABA的合成 | 第138-139页 |
| 6.3.8 基于细菌素EnlA的可控裂解系统提升短乳杆菌与乳酸乳球菌混合发酵体系GABA的合成 | 第139-141页 |
| 6.4 本章小结 | 第141-142页 |
| 第七章 结论与展望 | 第142-144页 |
| 7.1 主要结论 | 第142-143页 |
| 7.2 展望 | 第143-144页 |
| 附录 | 第144-152页 |
| 参考文献 | 第152-170页 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 | 第170-172页 |
| 读博期间科研成果 | 第170-171页 |
| El及核心 | 第171页 |
| 会议报告 | 第171-172页 |
| 个人简介 | 第172页 |
