| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 第一章:综述无脊椎动物的抗病毒RNAi途径 | 第15-33页 |
| 一、RNAi概述 | 第15-19页 |
| 1.RNAi定义 | 第15页 |
| 2.RNAi发现历程 | 第15-17页 |
| 3.siRNA和miRNA途径 | 第17-19页 |
| 二、RISC复合体中的分子Dicer,TRBP和Ago | 第19-25页 |
| 1. Dicer | 第19-20页 |
| 2. TRBP | 第20-22页 |
| 3. Ago | 第22-24页 |
| 4.参与RNAi的其他分子 | 第24-25页 |
| 三、RNAi与抗病毒免疫 | 第25-30页 |
| 1.Virus-Derived siRNAs的来源 | 第26页 |
| 2.RNAi抗病毒反应机制 | 第26页 |
| 3.果蝇中的抗病毒RNAi | 第26-29页 |
| 4.线虫中的抗病毒RNAi | 第29-30页 |
| 5.细胞内miRNA指导的抗病毒免疫 | 第30页 |
| 6.对虾中的抗病毒RNAi免疫 | 第30页 |
| 四、病毒与RNAi途径的互作 | 第30-33页 |
| 1.RNAi靶区域突变 | 第30-31页 |
| 2.编码病毒RNAi抑制剂 | 第31-33页 |
| 第二章 对虾TRBP和eIF6基因克隆和功能研究 | 第33-83页 |
| 一、引言 | 第33-35页 |
| 二、材料和方法 | 第35-53页 |
| 1.菌株,病毒和载体 | 第35页 |
| 2.试剂和仪器 | 第35-36页 |
| 3.实验材料 | 第36页 |
| 4.WSSV病原制备 | 第36-37页 |
| 5.对虾的免疫刺激,总RNA提取和cDNA合成 | 第37-38页 |
| 6.中国明对虾TRBP的克隆 | 第38-41页 |
| 7.TRBP的重组表达和蛋白纯化 | 第41-43页 |
| 8.利用纯化的TRBP重组蛋白进行T7噬菌体展示文库淘选 | 第43-44页 |
| 9.eIF6的克隆 | 第44页 |
| 10.eIF6的重组表达 | 第44-45页 |
| 11.序列分析 | 第45页 |
| 12.半定量RT-PCR | 第45-46页 |
| 13. Northern blot | 第46-48页 |
| 14.pull down实验 | 第48页 |
| 15.TRBP多克隆抗体制备 | 第48页 |
| 16. Western blot | 第48-49页 |
| 17.免疫细胞化学 | 第49-50页 |
| 18.病毒感染实验 | 第50页 |
| 19.日本囊对虾TRBP和eIF6 cDNA全长克隆 | 第50页 |
| 20.日本囊对虾TRBP不同dsRBD结构域的重组表达 | 第50-51页 |
| 21.Pull down鉴定TRBP结构域与eIF6之间的结合 | 第51页 |
| 22.dsRNA的合成 | 第51-52页 |
| 23.Gel-shift鉴定TRBP不同结构域与dsRNA之间的亲和力 | 第52-53页 |
| 24.对虾活体RNAi以及病毒感染实验 | 第53页 |
| 三、结果 | 第53-78页 |
| 1.基因克隆和序列分析 | 第53-57页 |
| 2.Fc-TRBP的重组表达和纯化 | 第57页 |
| 3.使用Fc-TRBP重组蛋白进行T7噬菌体展示文库淘选 | 第57-58页 |
| 4. Fc-eIF6的基因克隆,重组表达,蛋白纯化 | 第58-62页 |
| 5.Fc-TRBP和Fc-eIF6的组织分布和表达模式 | 第62-66页 |
| 6.Pull down实验验证Fc-TRBP和Fc-eIF6之间的结合 | 第66-67页 |
| 7.病毒感染实验证明TRBP参与对虾抗病毒先天免疫 | 第67-68页 |
| 8.日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)Mj-TRBP和Mj-eIF6的克隆及Mj-TRBP的不同结构域的重组表达 | 第68-72页 |
| 9.Pull down实验表明结构域TRBP的结构域B和C介导TRBP与eIF #6结合 | 第72-73页 |
| 10.Gel-shift实验检测Mj-TRBP不同结构域对dsRNA的亲和力 | 第73-74页 |
| 11.TRBP-DC通过介导全长分子二聚化而提高全长分子对dsRNA的亲和力 | 第74-76页 |
| 12.体内RNAi表明TRBP和eIF6参与dsRNA介导的RNA沉默。 | 第76-77页 |
| 13.RNAi表明TRBP和eIF6参与抗病毒免疫防御 | 第77-78页 |
| 四、讨论 | 第78-83页 |
| 1.TRBP和eIF6参与对虾抗病毒RNAi | 第78-80页 |
| 2.TRBP与eIF6结合,以及对dsRNA的亲和能力 | 第80-83页 |
| 第三章 中国明对虾Cathepsin C基因克隆和性质研究 | 第83-94页 |
| 一、引言 | 第83-84页 |
| 二、实验方法 | 第84-86页 |
| 1.实验材料 | 第84页 |
| 2.对虾的免疫刺激,总RNA提取和cDNA合成 | 第84-85页 |
| 3.中国明对虾Fc-Cath C的克隆 | 第85页 |
| 4.序列分析 | 第85页 |
| 5. Real time-PCR | 第85-86页 |
| 6.Fc-Cath C的重组表达和蛋白纯化 | 第86页 |
| 7.Fc-Cath C多克隆抗体制备 | 第86页 |
| 8.WSSV感染实验 | 第86页 |
| 三、结果 | 第86-92页 |
| 1.基因克隆和序列分析 | 第86-88页 |
| 2.Fc-Cath C的组织分布和表达模式 | 第88-91页 |
| 3.WSSV病毒感染实验 | 第91-92页 |
| 四、讨论 | 第92-94页 |
| 1.Fc-Cath C的表达模式 | 第92-93页 |
| 2.Cath C在对虾抗病毒先天免疫中的作用 | 第93-94页 |
| 第四章 中国明对虾翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的基因克隆和性质研究 | 第94-110页 |
| 一、引言 | 第94-96页 |
| 二、实验方法 | 第96-100页 |
| 1.实验材料 | 第96页 |
| 2.对虾的免疫刺激,总RNA提取和cDNA合成 | 第96页 |
| 3.中国明对虾Fc-TCTP的克隆 | 第96页 |
| 4.序列分析 | 第96-97页 |
| 5.Real time-PCR和半定量RT-PCR | 第97页 |
| 6.原位杂交 | 第97-100页 |
| 7.FcTCTP的重组表达和蛋白纯化 | 第100页 |
| 8.Fc-TCTP多克隆抗体制备 | 第100页 |
| 三、结果 | 第100-108页 |
| 1.基因克隆和序列分析 | 第100-104页 |
| 2.Fc-TCTP的表达模式 | 第104-106页 |
| 3.Fc-TCTP的重组表达以及Western blot结果 | 第106-108页 |
| 四、讨论 | 第108-110页 |
| 总结与创新点 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
| 在读期间发表文章 | 第124-145页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第145页 |
