| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 引言 | 第12-14页 |
| 第一部分 酵母双杂交技术筛选与SOX4相互作用的蛋白质 | 第14-26页 |
| 材料与方法 | 第14-20页 |
| 1.材料及来源 | 第14-15页 |
| ·菌株和质粒 | 第14页 |
| ·主要试剂 | 第14-15页 |
| 2.实验方法 | 第15-20页 |
| ·pGBKT7-SOX4(1-133)和pGBKT7-SOX4(130-380)载体构建 | 第15-17页 |
| ·Ubc9基因的钓取和克隆 | 第17页 |
| ·文库扩增 | 第17页 |
| ·酵母细胞的转化 | 第17-18页 |
| ·质粒提取、酶切片段纯化、PCR反应产物回收 | 第18页 |
| ·Western blot分析 | 第18页 |
| ·从酵母中提取质粒 | 第18-20页 |
| 结果 | 第20-25页 |
| 1.诱饵表达载体的构建和鉴定 | 第20页 |
| 2.诱饵蛋白在酵母细胞中的表达鉴定 | 第20-21页 |
| 3.诱饵蛋白在酵母细胞中自身转录激活活性的测定 | 第21页 |
| 4.人乳腺文库的扩增 | 第21-22页 |
| 5.初步筛选结果 | 第22页 |
| 6.重复鉴定结果 | 第22-23页 |
| 7.筛选到的基因cDNA序列的钓取及克隆 | 第23-25页 |
| 小结 | 第25-26页 |
| 第二部分 SOX4与Ubc9相互作用的验证 | 第26-38页 |
| 材料与方法 | 第26-32页 |
| 1.材料、试剂及仪器 | 第26-27页 |
| ·质粒、菌株、细胞株 | 第26页 |
| ·主要试剂 | 第26页 |
| ·细胞培养试剂 | 第26-27页 |
| 2.实验方法 | 第27-32页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第27-29页 |
| ·GST融合表达载体的构建 | 第29页 |
| ·GFP-SOX4和RFP-Ubc9融合表达载体的构建 | 第29-30页 |
| ·293T细胞瞬时转染 | 第30页 |
| ·GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第30页 |
| ·GST沉淀(GST pull-down)分析 | 第30-31页 |
| ·免疫共沉淀 | 第31-32页 |
| 结果 | 第32-37页 |
| 1.酵母表达载体的构建及鉴定 | 第32页 |
| 2.GST表达载体的构建，鉴定以及诱导表达与纯化 | 第32-33页 |
| ·GST表达载体的构建与鉴定 | 第32-33页 |
| ·GST-Ubc9融合蛋白的诱导表达与纯化 | 第33页 |
| 3.GFP-SOX4和RFP-Ubc9表达载体的构建 | 第33-34页 |
| 4.SOX4与Ubc9相互作用的验证 | 第34-37页 |
| ·SOX4及缺失突变体在酵母里与Ubc9的结合 | 第34-35页 |
| ·SOX4与Ubc9在体外的相互作用 | 第35页 |
| ·SOX4与Ubc9在体内的相互作用 | 第35-36页 |
| ·SOX4与Ubc9在活细胞内的共定位 | 第36-37页 |
| 小结 | 第37-38页 |
| 第三部分 SOX4与Ubc9复合物的初步功能研究 | 第38-49页 |
| 材料与方法 | 第38-41页 |
| 1 材料 | 第38-39页 |
| ·细胞株、质粒 | 第38页 |
| ·试剂及仪器 | 第38-39页 |
| 2.实验方法 | 第39-41页 |
| ·SOX11表达载体的构建 | 第39页 |
| ·Ubc9C93S突变体表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·细胞转染 | 第40页 |
| ·荧光素酶活性测定方法 | 第40-41页 |
| 结果 | 第41-48页 |
| 1.pDBD-SOX11载体的构建 | 第41页 |
| 2.pXJ40-HA-Ubc9C93S表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 3.Ubc9对SOX4转录活性的影响 | 第42-45页 |
| ·Ubc9抑制SOX4的转录活性 | 第42-43页 |
| ·Ubc9对SOX11的转录活性无影响 | 第43页 |
| ·Ubc9抑制SOX4的转录活性与其SUMO-1连接酶活性无关 | 第43-44页 |
| ·Ubc9在T47D细胞中抑制内源性的SON4的转录活性 | 第44-45页 |
| 4.SOX4和Ubc9对p53转录活性的影响 | 第45-46页 |
| 5.SOX4-Ubc9复合物对p53转录活性的影响 | 第46-48页 |
| 小结 | 第48-49页 |
| 讨论 | 第49-52页 |
| 总结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 附录 | 第57页 |
| 英文缩略词 | 第57-59页 |
| 发表的文章 | 第59-67页 |
